一种利用微生物发酵和微生物转化偶联生产尸胺的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于尸胺生产技术领域，是一种通过微生物发酵合成赖氨酸和微生物转化 赖氨酸偶联来生产尸胺方法，涉及到能分泌表达赖氨酸脱羧酶的高产赖氨酸的重组菌的构 建、重组菌发酵生产赖氨酸和重组菌表达赖氨酸脱羧酶转化赖氨酸三个方面。
【背景技术】
[0002] 尸胺(Cadaverine)是一种多胺，即1，5-戊二胺（简称戊二胺），在生物体内由赖氨 酸脱羧生成，是广泛存在于生物体中的具有生物活性的含氮碱，但也作为一种肉毒胺存在 于腐败物中。尸胺是合成新型材料聚酰胺_54(由尸胺和琥珀酸缩合而成)和聚酰胺_56(由 尸胺和乙二酸缩合而成）的重要原料，具有重要的工业用途。
[0003] 目前合成尸胺的方法有化学合成法和酶转化法。化学合成法条件苛刻、污染环境， 酶转化法过程复杂、成本较高。利用基因工程技术构造代谢工程菌来直接规模化制备人类 所需产品是最经济、环保和最有前途的方法，是代谢工程研究的方向和热点。
[0004] 微生物发酵法生产尸胺就是微生物利用糖类进行发酵，通过代谢直接大量合成尸 胺，这种方法简单、经济、环保和高效，但要求微生物既能高效合成L-赖氨酸脱羧酶，又能高 效合成L-赖氨酸，同时还能将尸胺转运到培养基中，防止尸胺对赖氨酸脱羧酶产生竞争抑 制。虽然大肠杆菌、尸杆菌、蜂房哈夫尼菌等可以直接合成尸胺，也对尸胺合成调节进行了 广泛研究，但这些菌不能大量合成赖氨酸，尸胺合成量低，不适合直接发酵生产。
[0005] 专利201180010538.5公布了一种利用微生物转化合成尸胺的方法，它构建了能分 泌表达赖氨酸脱羧酶的微生物，在发酵生产赖氨酸脱羧酶，然后向微生物培养基中投入赖 氨酸，从而把赖氨酸转化为尸胺。这种方法需要一定纯度的赖氨酸，需要另外的赖氨酸生产 和纯化工艺。
[0006] 专利201410004636.3公布了一种向赖氨酸发酵液中加入赖氨酸脱羧酶的方法来 生产尸胺。这种方法虽然不需要纯化赖氨酸，但需要生产和纯化赖氨酸脱羧酶，这是一个非 常复杂的工艺过程。
[0007]通过对比，本发明专利申请与上述专利公开文献存在本质的不同，本发明具有能 高效生产赖氨酸的大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌，而且有它们成熟的发酵工艺，该工艺条件下， 在10吨生物反应器里发酵，赖氨酸的产量分别达到126g/L和148g/L。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种通过微生物发酵合成赖氨 酸和微生物转化赖氨酸偶联来生产尸胺方法。
[0009] 本发明实现目的的技术手段如下：
[0010] -种利用微生物发酵和微生物转化偶联生产尸胺的方法，所述方法利用重组工程 菌株，通过微生物发酵合成赖氨酸和微生物转化赖氨酸偶联来生产尸胺，所述重组工程菌 株含有可诱导型的启动子-信号肽-赖氨酸脱羧酶基因-终止子的转录单元。
[0011] 而且，所述重组工程菌株为高产赖氨酸的谷氨酸棒杆菌重组菌或大肠杆菌重组 菌。
[0012] 而且，所述谷氨酸棒杆菌重组菌能够诱导分泌表达赖氨酸脱羧酶基因；或者，所述 大肠杆菌重组菌能够诱导分泌表达赖氨酸脱羧酶基因，或者，其自身的赖氨酸脱羧酶基因 CadA、LDC和赖氨酸尸胺反向转运蛋白基因 CadB以及它们的启动子或它们的表达调控系统 被删除，不能进行胞内表达。
[0013] 而且，所述转录单元以游离的质粒形式存在于重组工程菌株中，或者整合到重组 工程菌株的基因组中。
[0014] 而且，步骤如下：
[0015] ⑴利用重组菌株发酵来高效生产赖氨酸；
[0016]⑵诱导赖氨酸脱羧酶基因进行分泌表达，将赖氨酸转化成尸胺。
[0017] 根据权利要求5所述的利用微生物发酵和微生物转化偶联生产尸胺的方法，其特 征在于:所述步骤⑴按照赖氨酸发酵的常规生产工艺进行；
[0018] 或者，所述步骤⑵是在步骤⑴即将结束时，添加诱导剂和/或营养物质，诱导赖氨 酸脱羧酶表达至发酵液或周质腔，并将发酵液中的赖氨酸转化成尸胺。
[0019] 而且，所述诱导剂为IPTG或乳糖;或者，所述营养物质为菌体生长的培养基，或者 为有助于赖氨酸脱羧酶转化的辅助因子磷酸吡哆醛、磷酸吡哆醇或磷酸吡哆胺。
[0020] 而且，所述步骤⑴和步骤⑵在一个生物反应器里进行，或者，所述步骤⑴和步骤⑵ 在不同的生物反应器里进行。
[0021 ]本发明的优点和积极效果：
[0022]本发明方法将微生物发酵合成赖氨酸和微生物转化赖氨酸生成尸胺的过程偶联 起来，既不需要纯化赖氨酸，提高了尸胺的产量，也不需要纯化赖氨酸脱羧酶，具有生产工 艺简单、时间短、经济、生产效益高等优点，为生产尸胺提供了新途径，具有巨大的经济效益 和社会效益，市场开发前景广阔。
【附图说明】
[0023]图1为本发明cadB和cadA基因敲除的重组菌株EcoliLYS的PCR鉴定图；其中，1为 CadB和CadA基因敲除的重组菌株EcoliLYS;2为没有进行CadB和CadA基因敲除的菌株 EcoliLYS；
[0024] 图2为本发明中构建的含启动子-信号肽-cadA-终止子的转录单元的重组质粒 pTrc99a-CgR0040-cadA；
[0025] 图3为本发明中各菌株的尸胺产量图。
【具体实施方式】
[0026]下面结合实施例，对本发明进一步说明，下述实施例是说明性的，不是限定性的， 不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。
[0027] 本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域内的常规方法;本发明中所使 用的试剂，如无特殊说明，均为本领域内的常用试剂。
[0028] 本发明所涉及的技术术语的含义：
[0029] "尸胺" SP1，5-戊二胺。
[0030] "重组菌株"指非野生型菌株，包括通过诱变育种、基因工程育种或其它任何方法 获得的非野生型菌株。
[0031] "基因敲除"指敲除或突变目的基因、目的基因的核糖体结合位点、目的基因的启 动子或目的基因的调控基因，使目的基因不能表达或者不能表达成有活性的蛋白质(酶）。
[0032] "分泌表达"指表达的赖氨酸脱羧酶被运送到细胞外的培养基/发酵液中，或者是 运送大肠杆菌细胞的周质腔中。
[0033] "可诱导型的启动子"指通过诱导才能启动基因表达的启动子，诱导可以是添加某 种化学物质进行诱导，也可以改变温度进行诱导，例如温敏型的启动子。
[0034] "生物反应器"指任何可以提供适合细胞生长繁殖、赖氨酸发酵和微生物转化的容 器，可以是试管、摇瓶和发酵罐或其他定制的容器。
[0035] "高产赖氨酸的大肠杆菌或谷氨酸棒杆菌"可以是直接筛选的野生型菌株，也可以 是通过赖氨酸代谢途径的改造和或者通过诱变育种获得的重组菌株。
[0036 ]本发明所运用的技术手段：
[0037]本发明的出发菌株可以为高产赖氨酸的大肠杆菌EcoliLYS或谷氨酸棒杆菌 GluLYS，它们可以通过直接从自然界中筛选获得，也可以通过赖氨酸代谢途径的改造和或 者通过诱变育种获得。本发明的分泌表达的赖氨酸脱羧酶基因没有特别的限制，可以来源 于大肠杆菌、蜂房哈夫尼菌、鼠伤寒沙门氏菌等，但优选为L-赖氨酸脱羧酶。本发明的启动 子必须是可诱导型的启动子，可以是Lac(乳糖启动子）、Trp(色氨酸启动子）、Tac(乳糖和色 氨酸的杂合启动子）、1PL(1噬菌体的左向启动子）、T7噬菌体启动子等。本发明的信号肽是 任意一种可以引导赖氨酸脱羧酶分泌至培养基或周质腔的氨基酸序列，它可以是来自于 PET系列质粒上的pelB信号肽，也可以是来源于大肠杆菌的SufKfts I抑制剂)信号肽，来 源于枯草芽孢杆菌的PhoD(磷酸酯酶）、LipA(脂肪酶)和arpE信号肽，来源于谷氨酸棒杆菌R 的CgR0079、CgR0120、CgR0124和CgR0040等信号肽。这些基因、启动子和信号肽序列都可以 在GenBank、有关质粒图谱和相应的参考文献上查阅到，对于本领域的技术人员而言是公开 的。
[0038] 本发明所进行的分子生物学操作，如PCR、酶切、链接、转化和转化子的筛选等，均 按照《分子克隆实验指南》（第三版，黄培堂等译）进行。大肠杆菌的基因敲除所用的质粒 pKD3、pKD46和pCP20及其基因敲除方法按照DatsenkoKA等的论文（Proc Natl Acad Sci USA，2000，97 (12): 6640~6645)进行。文献按照大肠杆菌质粒pTrc99a，谷氨酸棒杆菌质粒 pKISmobsacB、微生物培养技术及尸胺的检测等，对于本领域的技术人员而言都是公知的。
[0039] -种利用微生物发酵和微生物转化偶联生产尸胺的方法，该方法利用重组工程菌 株，通过微生物发酵合成赖氨酸和微生物转化赖氨酸偶联来生产尸胺。
[0040] 较优地，所述重组工程菌株为高产赖氨酸的谷氨酸棒杆菌和大肠杆菌。
[0041] 较优地，所述的高产赖氨酸的谷氨酸棒杆菌重组菌，它能够诱导分泌表达赖氨酸 脱羧酶基因。
[0042] 较优地，所述重组工程菌株含有可诱导型的启动子-信号肽-赖氨酸脱羧酶基因-终止子的转录单元。
[0043]较优地，所述的转录单元可以以游离的质粒形式存在于高产赖氨酸的谷氨酸棒杆 菌中，也可以整合到高产赖氨酸的谷氨酸棒杆菌基因组中。
[0044] 较优地，所述的高产赖氨酸的大肠杆菌重组菌，它自身的赖氨酸脱