可杀鳞翅目昆虫、植物线虫和鞘锈菌的苏云金芽孢杆菌及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及植物保护剂，尤其涉及一株可高效防治鳞翅目昆虫、植物寄生性线虫 和植物鞘锈菌的苏云金芽孢杆菌。
【背景技术】
[0002] 苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，Bt)是一种昆虫病源细菌，为革兰氏 阳性杆菌，为国内外著名的害虫生防菌。由于其对特定的昆虫具有毒性，且毒性大小依昆虫 的种类不同。苏云金芽孢杆菌制备的杀虫剂是对人类和环境友好的安全型细菌杀虫剂，目 前Bt杀虫剂已被广泛应用。与化学农药相比，使用Bt杀虫剂防治害虫成本较高。若在生物防 治中使用超高效的细菌杀虫剂，就可降低其使用剂量和成本。因此，高效杀虫Bt菌株的筛选 获得及其植物保护菌剂的制备方法研究就显得很重要。
[0003] 有文献报道了苏云金芽孢杆菌可应用于防治害虫和植物线虫，如中国专利 ZL200410050065.3公开了一种苏云金芽孢杆菌及其菌剂，该菌株或其菌剂能有效防治植物 线虫以及鳞翅目地下害虫外，还具有促进植物生长等作用。但其发酵菌剂浓度需每升毫克 级以上，才能杀死害虫。中国专利ZL200910210143.4公开了一种拮抗害虫的新颖苏云金芽 孢杆菌，应用于生物性控制虫害的技术领域，所需浓度也是每升毫克级以上。尤其是，目前 还没有人从自然资源中尤其是植物组织杂质中筛选出一株Bt菌同时具有三种植物保护功 能，即可高效杀死多种鳞翅目昆虫，植物寄生性线虫和植物鞘锈菌。
【发明内容】
[0004] 有鉴于此，本发明提供了一株可杀鳞翅目昆虫、植物线虫和鞘锈菌的苏云金芽孢 杆菌。
[0005] 本发明米用的技术手段如下：一株苏云金芽孢杆菌的微生物保藏号为CGMCC No . 11769，拉丁文名称为Bacillus thuringiensis，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理 委员会普通微生物中心。
[0006] 优选地，苏云金芽孢杆菌的发酵物成分包括孢子、晶体和8种以上胞外蛋白，晶体 和胞外蛋白具有尚毒性。
[0007] 另一方面，一株苏云金芽孢杆菌，应用于杀害鳞翅目昆虫、植物线虫和鞘锈菌。
[0008] 优选地，鳞翅目昆虫包括向日葵带状蛾、大菜粉蝶、菜青虫、菜尺蠖、黄地老虎、榆 树尺蠖、欧洲玉米螟和东方玉米螟，植物线虫包括根结线虫和香蕉螺旋线虫，鞘锈菌包括鸡 蛋花鞘锈菌。
[0009] 另一方面，一种菌剂，其活性成分为苏云金芽孢杆菌的发酵物。
[0010] 优选地，该菌剂应用于防治植物病虫害。
[0011] 本发明所提供的苏云金芽孢杆菌Bt 00-50-5菌株能产椭圆形孢子、菱形晶体和8 种以上孢外蛋白（分子量：170，133,60,45,27，15，13和71^ &)，其中，晶体和孢外蛋白具有高 毒性，可高效杀死鳞翅目昆虫，植物寄生性线虫和植物鞘锈菌。
[0012] 采用本发明的苏云金芽孢杆菌Bt00-50-5发酵成菌剂，无需过滤，可将液体发酵物 直接使用，防治植物病虫害，或使用发酵物的冷冻真空干燥成固体粉末，利用率为100%。适 合大规模生产应用。
【附图说明】
[0013] 图1为本发明的苏云金芽孢杆菌发酵物各组分的形态，其中A、晶体和孢子混合物 的形态;B、晶体形态;C、孢子形态；
[0014]图2为溶解Bt 00-50-5发酵产物孢外蛋白的葡聚糖凝胶G-75柱层析图；
[0015]图3为实施例2的分别使用本发明的苏云金芽孢杆菌Bt00-50-5菌剂、自来水、化学 农药喷施正在生长的白菜后的效果图；
[0016]图4为实施例3的不同剂量的苏云金芽孢杆菌Bt 00-50-5菌剂对香蕉螺旋线虫 H.Multicinctus防治效果图，其中D10，D20和D40为苏云金芽孢杆菌Bt00-50-5菌剂的稀释 倍数，对照（Contro 1)为自来水；
[0017]图5为实施例4的不同剂量的苏云金芽孢杆菌00-50-5杀害根结线虫Meloidogyne incognita防治效果图；其中D10，D20和D40为苏云金芽孢杆菌Bt00-50-5菌剂的稀释倍数， 对照（Contro 1)为自来水；
[0018] 图6为实施例5的苏云金芽孢杆菌Bt00-50-5菌剂对根结线虫Meloidogyne incognita的防效图，其中G为正常的根结线虫，Η为Bt00-50-5菌剂处理过的根结线虫；
[0019]图7为实施例6的苏云金芽孢杆菌Bt00-50-5菌剂防治植物病原真菌鸡蛋花鞘绣菌 的效果图。其中：1和K分别为未处理的蛋花鞘绣菌培养36h、48h的孢子堆形态;J和L分别为 用Bt00-50-5菌剂处理鸡蛋花鞘绣菌培养36h、48h的孢子堆形态;M、未处理的鸡蛋花鞘绣菌 培养72h后的形态;N、用Bt00-50-5菌剂处理鸡蛋花鞘绣菌培养72h的孢子形态。
【具体实施方式】
[0020] 以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实施例只用于解释本发明，并非用于 限定本发明的范围。
[0021] 本发明的苏云金芽孢杆菌（生物菌株00-50-5)菌株微生物保藏号为CGMCC No. 11769;拉丁文名称为Bacillus thuringiensis，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委 员会普通微生物中心(CGMCC);保藏地址:CGMCC，北京市朝阳区北晨西路1号院3号，中国科 学院微生物研究所;保藏日期:2015年12月1日。
[0022]本发明苏云金芽孢杆菌Bt00-50-5是从自然界中的向日葵组织碎片杂质中筛选 的。本发明苏云金芽孢杆菌Bt00-50-5的微生物特征为革兰氏染色阳性，能产椭圆形孢子、 菱形晶体和8种以上孢外蛋白，如图1和图2所示。其中，8种以上孢外蛋白（分子量：170,133， 60，45，27，15，13和7kDa)，经测试毒性，7kDa的孢外蛋白毒性最高，133，60，45，27，15和13六 种孢外蛋白有毒，可高效杀死鳞翅目昆虫，植物寄生性线虫和植物鞘锈菌。
[0023] 通过对苏云金芽孢杆菌Bt00-50-5菌株基因的核苷酸序列鉴定。Bt00-50-5DNA基 因组共含50万个以上核苷酸;合成6000多个不同功能的蛋白质。苏云金芽孢杆菌Bt00-50-5 还产生3个与溶解细胞有关的蛋白，分别为Toxin Doc蛋白毒素，芽孢杆菌溶血毒素 HBL和小 带带毒素 Zot，用于抑制细胞生长，加快溶解和渗透细胞，其氨基酸系列表与现有技术中的 苏云金芽孢杆菌公开的氨基酸序列表相似度非常高(相似度为98-100% )。
[0024] 但是本发明的苏云金芽孢杆菌Bt00-50-5产生3个cry晶体蛋白（如cry22AAl-like 1:〇叉;[11)，4个071:细胞溶解蛋白毒素（如07七21^131：(?;[11)，一个￥1口营养体细胞分泌蛋白（如 vip3BAl_like toxin);其中本发明的苏云金芽抱杆菌Bt00-50_5的 1、cry22AAl_l ike toxin、2、cyt2Bal3toxin和3、vip3BAl_like toxin对应的具体DNA核苷酸系列表见附表。其 氨基酸序列表与现有技术中的苏云金芽孢杆菌公开的氨基酸序列表相似性较低(相似度为 24.11to 35.58%)，如苏云金芽孢杆菌财00-50-5的0巧224&1-1丨1?5毒蛋白序列与苏云金芽 孢杆菌cry22Aal序列相比，最多32.58%相一致。这些已知Bt菌毒蛋白可以杀许多种类的害 虫，特别是vip3Bal-l ike，具有更广泛的植物保护功能。
[0025] 苏云金芽孢杆菌Bt 00-50-5菌株有三种不同的活性，均可高效杀死鳞翅目昆虫， 植物寄生性线虫和植物鞘锈菌。其中本发明杀死植物鞘锈菌的苏云金芽孢杆菌Bt00-50-5 为国内外首次筛选获得，防治植物病害虫效果最佳。
[0026] 苏云金芽孢杆菌Bt00-50-5的具体筛选方法：
[0027]将野外采集的向日葵样本编号，如00-01到00-80,在冷库储存。每5个储存的样品 (100克:如00-01 和00-02，^-00-05混合在一起;如00-46，00-47，^-00-50混合在一起），用破 碎机把植物组织破碎。放置，自然沉降，过夜后去沉淀，用上面的悬浮液作为生物活性测定 样品。高效杀虫细菌筛选的靶标昆虫是向日葵带状蛾。用人工饲料饲养向日葵带状蛾，每管 (共25管)一个有微孔泡沫条，滴上不同浓度的样品悬浮液，含0.05%Triton X-100，加入一 头二龄幼虫，3天后记录死亡虫数。如那组混合样品有毒性，再分别用每一个样品制备悬浮 液，进行活性测定。找到可杀虫的样品。接着用可杀虫的悬浮液，接种到牛肉膏-蛋白胨细菌 培养基平板，在30°C细菌生长12小时，挑选单独菌落，再转接到另一个牛肉膏-蛋白胨细菌 平板培养12小时，然后再选择单独的细菌菌落的一半，再次转接到牛肉膏-蛋白胨细菌平板 培养基平板，培养4天。细菌染色鉴定：用苯酚-碱性品红染色液染色，如发现着色的菱形晶 体和椭圆形的孢子。最后将上代细菌的另一半菌落，扩大培养并生测，SDS-聚丙烯酰胺电泳 鉴定，如Bt 00-50-5含133,000(含原毒素)和60,000道尔顿(含毒素)大小的蛋白。其中培养 基选用牛肉膏和蛋白胨液体培养基，培养基含0.5%牛肉膏和1%蛋白胨，用自来水稀释，用 NaOH调节pH到7.2，于121°C灭菌20分，冷却后放置24小时备用。
[0028]苏云金芽孢杆菌Bt00-50-5的发酵方法为常规方法，本发明的苏云金芽孢杆菌 Bt00-50-5菌剂为苏云金芽孢杆菌Bt00-50-5的发酵产物，包含晶体，孢子，上清液孢外蛋白 和少数营养体。
[0029]通过生物活性测试证明苏云金芽孢杆菌Bt00-50-5晶体和胞外蛋白均可杀菜尺蠖 (Trichoplusia ni);孢子没有毒性，其杀虫特性不同于已报道的其它Bt菌株。其发酵产物 可全部回收，可采用冷冻旋转喷雾干燥法进行工业发酵制备菌粉或制备菌剂。经测试，由于 苏云金芽孢杆菌Bt00-50-5的发酵物成分包含晶体(有毒），孢子(负责遗传、再生），孢外蛋 白（有毒)和少数营养体菌剂，这不同于传统的苏云金芽孢杆菌菌剂的制备方法。传统的苏 云金芽孢杆菌由于发酵上清液含的孢外蛋白毒性太低，所以一般要将发酵物经过板框过滤 掉孢外蛋白，剩下的孢子和晶体混合物为杀虫剂，发酵物利用率较低、工艺繁杂导致菌剂制 备成本高。
[0030] 苏云金芽孢杆菌Bt00-50-5发酵成菌剂，无需过滤，可将液体发酵物直接使用，防 治植物病虫害，或使用发酵物的冷冻真空干燥剂，利用率为100%。适合大规模生产应用。
[0031] 实施例1:测试苏云金芽孢杆菌Bt00-50-5菌剂(包含晶体，孢子，上清液孢外蛋白 和少数营养体)的生物杀菌活性。
[0032]苏云金芽孢杆菌Bt00-50-5菌剂对鳞翅目昆虫的杀虫活性实验如下：
[0033]供试昆虫或线虫：向日葵带状蛾、大菜粉蝶、菜青虫、菜尺蠖、黄地老虎、榆树尺蠖、 欧洲玉米螟、东方玉米螟。
[0034]向日葵带状蛾采用每管一虫测定法:用人工饲料饲养幼虫;每管顶部打孔，放入一 个有微孔的泡沫条，滴上不同浓度的Bt菌剂悬浮液，含0.05 % Triton X-100，每管加入一头 二龄幼虫，3天后记录死亡虫数。
[0035]大菜粉蝶采用浸叶法，剪抱球甘蓝叶片，浸入不同浓度的Bt菌剂悬浮液，含0.05 % Triton X-100，30秒，在滤纸上干燥，每瓶加入10头二龄幼虫，3天后记录死亡虫数。