一种分层包装带指示剂的直接实时定量荧光pcr方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及分子生物学领域，特别涉及一种分层包装带指示剂的直接实时定量荧 光PCR方法。
【背景技术】
[0002] 聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction，PCR)是一种根据生物体内DNA复 制性质而设计的体外快速扩增特定DNA序列的技术。PCR反应体系主要由核酸引物、4种 dNTP、DNA聚合酶、模板DNA和PCR反应缓冲液体系组成。自美国Cetus公司人类遗传室Kary Mullis及其同事于1985年发明聚合酶链式反应(PCR)以来，PCR技术及其衍生技术就被快速 开发出来，并在多种核酸检测中得到了广泛的运用。尤其是病毒或其他病原体的检测，当知 道待检病原某一特定基因片段时，即可利用特异性的引物对样品中微量的目标DNA进行PCR 扩增，使其达到检测量，通过适当的检测手段进行检测，即可确定病原体的存在与否。
[0003] 实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用DNA扩增过程中 荧光信号的积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方 法。与普通的PCR相比，实时荧光定量PCR技术具有特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准 确、速度快、全封闭反应等优点，实现了PCR的定量分析。
[0004] 目前，无论临床实验室检测还是疫情处理，传染病病原的核酸荧光PCR检测技术， 均需经过核酸提取或纯化过程，该过程需要专门的实验室环境和相应设备，实验操作人员 需经专业培训；另外，这样的操作增加了实验操作步骤，并延长了检测时间，增加了污染的 几率。同时，DNA聚合酶与PCR反应试剂的混合接触，也会导致其活性的降低，从而降低实时 荧光定量PCR的敏感性。
[0005]因此，需要找到一种试剂稳定性好、操作简便、定量准确的实时定量荧光PCR方法。
【发明内容】
[0006] 本发明要解决的技术问题是针对实时定量荧光PCR过程中核酸提取操作复杂，容 易产生污染，且PCR灵敏度低的缺点，提供了一种试剂稳定性好、操作简便、定量准确的直接 实时定量荧光PCR方法。
[0007]为了解决上述技术问题，本发明提供的技术方案为：
[0008] -种分层包装带指示剂的直接实时定量荧光PCR方法，将热启动DNA聚合酶和PCR 扩增反应液各自分层包装在PCR扩增管内，使用时加入核酸裂解液和待测样品，进行实时定 量荧光PCR。
[0009]本发明技术方案的具体实施步骤为：
[0010] 1)用熔点为50°C~55°C的石蜡油混合物包被热启动TaqDNA聚合酶，并置于PCR扩 增管管底；
[0011 ] 2)混合引物、探针、TriS碱、氯化镁、氯化钾、石绿和dNTP，制得焚光PCR扩增试剂于 石蜡油混合物上层；
[0012] 3)用熔点为40°C~45°C的石蜡油封闭所述荧光PCR扩增试剂于步骤1)的PCR扩增 管内；
[0013] 4)石蜡油冷凝后，加入核酸裂解试剂和待测样品；
[0014] 5)检测样品。
[0015]在本发明的技术方案中，发明人采用分层包装的方法将热启动DNA聚合酶和PCR扩 增反应液分别用石蜡油混合物包被，使二者彼此分开而不混合，以此保证聚合酶的活性，防 止聚合酶因直接与PCR扩增反应液混合而导致的活性降低。
[0016]作为优选，所述热启动DNA聚合酶为TaqDNA聚合酶。
[0017] 作为优选，所述PCR扩增反应液包括引物、探针、Tris碱、氯化镁、氯化钾和dNTP。
[0018]作为优选，在本发明的一个实施方式中，发明人利用石蜡油混合物对所述热启动 DNA聚合酶和PCR扩增反应液进行分层包装。作为优选，所述石蜡油混合物包括石蜡油和树 月旨。更优选地，所述石蜡油为优质石蜡油，所述树脂为安息香。
[0019]作为优选，在本发明的一个实施方式中，所述石蜡油混合物的熔点不低于40°C。同 时，调节石蜡油和树脂的混合比例将石蜡油混合物配制成熔点为50°C~55°C和40°C~45°C 的石蜡油混合物。所述热启动DNA聚合酶通过熔点为50°C~55°C的石蜡油混合物被包装在 PCR扩增管底部，所述PCR扩增反应液通过熔点为40°C~45°C的石蜡油混合物被包装在热启 动DNA聚合酶的上部。将热启动DNA聚合酶和PCR扩增反应液分别用不同熔点的石蜡油混合 物包被，可以使PCR反应试剂在加热时首先释放并与已裂解好的样品充分混合，且此时不会 影响聚合酶的活性，防止聚合酶因直接与PCR扩增反应液混合而导致的活性降低。待加热至 72°C时，聚合酶充分释放，并与液体充分混合，以保证后续实验的顺利进行。
[0020] 为了便于观察石蜡油的分层包装的效果，作为优选，在本发明的一个实施方式中， 所述PCR扩增反应液中含有指示剂。更优选地，所述指示剂选自溴酚蓝、石绿、甲基红、甲基 橙、罗丹名、溴甲酚绿、品红、二甲酚橙、二苯胺或刚果红中的一种。
[0021] 同时作为优选，在本发明的一个实施方式中，所述核酸裂解液中也含有指示剂，且 PCR扩增反应液中的指示剂与核酸裂解液中的指示剂不同。这样不仅能够保证石蜡油混合 物的分层包装效果，同时也可保证样品加入的准确性，防止多加、错加、漏加。
[0022]更优选地，在本发明的另一个实施方式中，所述指示剂的加入量低于O.Olwt%。
[0023]在本发明中，所述热启动DNA聚合酶的用量和PCR扩增反应液中各个组分的比例可 以根据需要设置。作为优选，在本发明的一个实施方式中，所述热启动DNA聚合酶浓度为2.5 ~3.5U/yL;所述PCR扩增反应液中包含浓度为30~50nmolAxL的上下游引物和10~30nmol/ yL的探针、10 ~30nmolAiL的Tris碱、10 ~30mmolAiL氯化镁、100 ~200mmolAiL氯化钾、150 ~250umolAiL的dNTP和不多于O.OOlwt%的石绿指示剂。
[0024]在本发明中，所述PCR扩增反应液的包装方法为:将20~30yL所述PCR扩增反应液 加入到包装好的热启动DNA聚合酶的上部，加入15~25yL熔点为40~45°C的石蜡油混合物， 来封闭PCR扩增反应液。
[0025]在所述PCR扩增反应液包装完成后，在其上方加入核酸裂解液。得到的含有热启动 DNA聚合酶、PCR扩增反应液和核酸裂解液的PCR扩增管可立即使用也可封装后冷藏保存。
[0026]作为优选，在本发明的一个实施方式中，所述核酸裂解液由0.2~0.4N氢氧化钠、 0.3~0.6M氯化钾、0.01~0·05%Ν-月桂酰肌氨酸钠、5mMEDTA、0.3~0.6MTris-HCL和1~ 2%曲通X-100组成。
[0027]更优选地，在本发明的另一个实施方式中，所述核酸裂解液由0.3N氢氧化钠、 0.45M氯化钾、0.03%N-月桂酰肌氨酸钠、0.45MTris-HCL、5mMEDTA和1%曲通X-100组成。
[0028]本发明中所述核酸裂解液可根据需要任意设置。作为优选，在本发明的一个实施 方式中，所述核酸裂解液的加入量为15~25yL，更优选地为20yL。
[0029] 作为优选，在本发明的一个实施方式中，在加入核酸裂解液和待测样品后对所述 PCR扩增管37°C加热5min，然后在72°C条件下加热30s，500rpm离心后进行实时定量荧光 PCR〇
[0030]更具体地，利用本发明的直接实时荧光定量PCR的方法进行PCR定量检测，包括如 下步骤：
[0031] 1)将15~25yL待测样本加入到含有热启动DNA聚合酶、PCR扩增反应液和核酸裂解 液的PCR扩增管中，轻轻摇匀；
[0032] 2)将上述PCR扩增管放置在具有制冷功能的干热器上运行37°C，5min; 72°C，30s， 然后将管内分层试剂颠倒混匀，500rpm水平离心30秒钟。
[0033] 3)将所得PCR扩增管放置于PCR仪中，并实时监测荧光信号。
[0034]为了更好的裂解样品，可以在进行PCR扩增前低速离心PCR扩增管，以减少管壁和 管盖上黏附的核酸裂解液，从而充分裂解样品，所述低速离心的转速可以为100~500rpm/ min〇
[0035] 在本发明中，发明人利用熔点为40°C~45°C和50°C~55°C的石蜡油混合物将分别 将热启动DNA聚合酶、PCR扩增反应液和核酸裂解液隔离，以此保证热启动DNA聚合酶不会因 与PCR反应液混合而导致的活性降低。同时，核酸裂解液位于混合物的上层，加入待检样品 后，在具有制冷功能的干热器上运行37°C，5min。此步骤不仅可以保证核酸裂解液在37°C环 境下可以与待检样品充分混合，且能加快裂解效率，实现样品核酸的彻底裂解和释放。同时 在37°C环境下不会影响PCR反应试剂与热启动DNA聚合酶的保存状态及活性，实现一管内的 不同反应。在具有制冷功能的干热器上运行72°C，30s步骤中，可以使热启动DNA聚合酶、PCR 扩增反应液、已经释放出的核酸充分混匀，为后续实验的顺利进行提供保证。在干热器进行 石蜡油的融化程序后，将管内分层试剂颠倒混匀，500rpm离心30秒钟，直接进行荧光PCR扩 增。
[0036]作为优选，所述待测样品包括但不限于培养的细胞、细菌、血清、血浆、唾液、尿液 或胸腹水等，优选为血清或血浆。所述待测样品体积为15~25yL，优选地为20yL，所述样品 加入核酸裂解液后，轻轻晃动使其与检测样本充分混匀。
[0037] 本发明适用的检测项目包括乙肝病毒、CMV、EBV等DNA病毒及人血清、血浆基因组 核酸检测。
[0038]本发明中的实时定量荧光PCR反应条件可根据需要设置。作为优选，在本发明的一 个实施方式中，所述PCR扩增程序为:37°C，2min; 95°C，lOmin;然后以95°C，10s和61°C，45s 进行45~50个循环。在61°C检测焚光信号。
[0039]本发明的有益效果为：
[0040]本发明的直接实时荧光定量PCR的方法，将热启动DNA聚合酶、PCR扩增反应液和核 酸裂解液分别采用不同熔点梯度的石蜡油进行分割。此方法不仅可以使热启动DNA酶与PCR 扩增反应液所处环境相互独立，保证热启动DNA聚合酶的活性，同时为核酸裂解液和待检样 品的充分反应提供了一个独立的环境以保证待检样品中的核酸充分释放。同时，采用不同 颜色的指示剂对PCR扩增反应液和核酸裂解液进行区分，保证石蜡油分割的有效性以及后 续血清/血浆等样本加入充分混匀的可靠性。试剂预先制备包装后，用户只需将采集的血 清、血浆、唾液、尿液或胸腹水等微量样本直接加到PC