一种鉴别空肠弯曲杆菌和结肠弯曲杆菌双重pcr引物及其鉴别方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种双重PCR引物及其鉴别方法。
【背景技术】
[0002] 空肠弯曲杆菌(Campylobacterjejuni)和结肠弯曲杆菌(Campylobactercoli)属 于弯曲杆菌属，是人畜共同感染的细菌性肠道病原菌，可以引起人和动物发生多种疾病。弯 曲杆菌对动物和人类表现出不同程度的危害，禽类感染该菌一般会导致下痢、肝脏变性出 血及产蛋下降为等症状，火鸡则会引发肝炎和蓝冠病;空肠弯曲杆菌还可引起羊流产，对养 殖业造成极大的经济损失。对人类致病主要表现为急性肠炎，免疫力低下者还会继发格林-巴利综合征(Guillain-Barrisyndrome，GBS)。弯曲杆菌主要通过饮水，食物等方式传染给 动物和人类，其感染的病例数已经超过李斯特菌病，沙门菌病和志贺菌病，在引起的感染中 超过80 %是由空肠弯曲杆菌引起，约10 %是由结肠弯曲杆菌引起，其他弯曲杆菌也偶尔致 病。
[0003] 近年来，我国鸡群大规模爆发弯曲杆菌病的报道也越来越多，虽然发病率高、死亡 率低、多呈慢性经过，但其对鸡群潜在的影响却不容忽视，空肠弯曲杆菌和结肠弯曲杆菌感 染的临床症状不明显且不易区分，因此很难通过临床症状判断感染情况。建立快速而特异 的检测方法是有效诊断空肠弯曲杆菌和结肠弯曲杆菌感染的关键所在。目前对弯曲杆菌的 常规检测鉴定主要是增菌培养生化鉴定，但是由于空肠弯曲杆菌和结肠弯曲杆菌在食品样 品中的含量很低，生长条件比较苛刻，常规检测及鉴定方法繁琐耗时，伴随着假阳性和假阴 性菌株的不断发现，一些初步的生化试验项目已经不能有效鉴别出空肠弯曲杆菌和结肠弯 曲杆菌，传统的鉴别方法面临着巨大的挑战，因此有必要寻找更加有效地鉴别空肠弯曲菌 的检测方法。近年来随着分子生物学，特别是PCR方法快速发展，已成为快速，可靠和灵敏检 测病原体感染的工具。PCR检测方法目前已经广泛运用到细菌的分离鉴定之中，它具有快速 简单、特异性强和敏感性高等特点。已报道的PCR方法常用的靶基因有16SrRNA、23SrRNA、 flaA或f]^、〇6此、〇3(^、11丨口0、〇(^六13(^15^等，其中11丨口0是空肠弯曲杆菌所特有的，它可以 有效鉴别空肠弯曲杆菌。细胞致死性膨胀毒素cdtC，是结肠弯曲杆菌重要的毒力因子之一。
【发明内容】
[0004] 本发明提供了一种鉴别空肠弯曲杆菌和结肠弯曲杆菌双重PCR引物及其鉴别方 法。
[0005] 本发明选择hipO，cdtC为靶序列，设计特异性引物，建立双重PCR方法用于空肠弯 曲杆菌和结肠弯曲杆菌的鉴别。
[0006] 本发明的一种鉴别空肠弯曲杆菌和结肠弯曲杆菌双重PCR引物，是根据GenBank中 发表的空肠弯曲杆菌hipO基因序列和结肠弯曲杆菌cdtC基因序列，设计2对特异性引物，具 体如下：
[0007] hipOFATCAACATTGCGAGATAC；
[0008] hipORTAGACTTACAAGGCGAAT；
[0009] cdtCFGGATATGCACTCTCAAGATTTG；
[0010] cdtCRCTTGCTTAGTTCGGTTACAATAG。
[0011] 本发明的一种鉴别空肠弯曲杆菌和结肠弯曲杆菌的双重PCR方法，它是按照以下 步骤进行的：
[0012] -、提取待检测样本的基因组DNA;
[0013] 二、以步骤一的基因组DNA为模板，将上述的引物对放入同一PCR反应体系中，进行 PCR扩增；
[0014]三、PCR产物经1 %琼脂糖凝胶电泳检测；
[0015]四、对扩增片段进行分析：在653bp和313bp位置有两条扩增条带，表示样品为阳 性，待检测样品中同时含有空肠弯曲杆菌和结肠弯曲杆菌。
[0016] 本发明包含以下有益效果：
[0017] 本发明通过对空肠弯曲杆菌(包括空肠亚种和德莱亚种)所特有的马尿酸酶基因 (hipO)和结肠弯曲杆菌cdtc基因进行扩增，建立双重PCR方法，对hip0，cdtc基因的扩增产 物分别为653bp和313bp，基因片段大小的差异就可以在琼脂糖凝胶电泳上区分两条片段， 能够在一次PCR中检测出两种弯曲杆菌。通过序列同源性分析，本发明所选择的菌株hipO， cdtC基因序列与空肠弯曲杆菌和结肠弯曲杆菌其他菌株同源性较高，因此此方法的建立不 仅用于空肠弯曲杆菌RM1221菌株与结肠弯曲杆菌RM5611菌株的鉴别，也适用于其他菌株的 空肠弯曲杆菌和结肠弯曲杆菌鉴别。双重PCR方法的敏感性达到了6.68Xl(T2μg/ml;特异性 试验中空肠弯曲杆菌和结肠弯曲杆菌有特异性条带，其他细菌没有扩增出特异性条带，说 明该方法对空肠弯曲杆菌和结肠弯曲杆菌具有良好特异性，并且符合试验中该方法与单 PCR方法的结果一致。这种方法的建立不仅可以准确检测和鉴定空肠弯曲杆菌和结肠弯曲 杆菌，大大节省了生化试验所消耗的成本和时间，而且特异性、敏感性高，更加适用于临床 样品分离鉴定和流行病学调查。本发明不仅可以对分离出的可疑菌落进行快速鉴定，而且 还可以对检测样品的增菌液直接进行筛选检测，使可疑菌株的分离更具有针对性，从而提 高了检出率。实现对空肠弯曲杆菌，结肠弯曲杆菌简便、快速的鉴定，可应用于临床诊断、食 品卫生监控及进出口食品病原微生物检测等各个方面，也为公共卫生的预警提供支持。
【附图说明】
[0018]图1为确定的双重PCR退火温度的电泳图；其中，M:DL2000 DNA Marker; 1:50°C;2: 51°C；3：52〇C；4：53〇C；5：54〇C；6：Negative control；
[0019]图2为PCR敏感性检测结果电泳图；其中，M:DL2000DNAMarker;l:66.8yg/ml;2: 6 · 68yg/ml; 3:6 · 68X10-Vg/ml; 4:6 · 68X10-2yg/ml; 5:6 · 68X10-3yg/ml; 6:6 · 68X10-Vg/ ml；7：Negativecontrol；
[0020] 图3为双重PCR特异性扩增实验电泳图；其中，M:DL2000DNAMarker1 :CampylobacterjejuniCampylobactercoli;2:多杀性巴氏杆菌3:单核细胞李斯特杆菌； 4:产气荚膜梭菌;5:伤寒沙门氏菌;6:金黄色葡萄球菌7:Negativecontrol;
[0021] 图4为临床样品检测电泳图；其中，M:DL2000DNAMarker;l:样品1;样品2:样品 2;3:样品3;4:样品4;5:样品5;6:样品6;7 :样品7 ;8:样品8;9:样品9; 10:样品10; 11:样品 样品 12;13:样品 13;14:样品 14;15:样品 15;16:样品 16;17:样品 17;18:样品 18;19: 样品19; 20:样品20。
【具体实施方式】
[0022]【具体实施方式】一:本实施方式的一种鉴别空肠弯曲杆菌和结肠弯曲杆菌双重PCR 引物，是根据GenBank中发表的空肠弯曲杆菌hipO基因序列和结肠弯曲杆菌cdtC基因序列， 设计2对特异性引物，具体如下：
[0023] hipOFATCAACATTGCGAGATAC；
[0024] hipORTAGACTTACAAGGCGAAT；
[0025] cdtCFGGATATGCACTCTCAAGATTTG；
[0026] cdtCRCTTGCTTAGTTCGGTTACAATAG。
[0027]【具体实施方式】二：本实施方式的一种鉴别空肠弯曲杆菌和结肠弯曲杆菌的双重 PCR方法，它是按照以下步骤进行的：
[0028]一、提取待检测样本的基因组DNA;
[0029]二、以步骤一的基因组DNA为模板，将上述的引物对放入同一PCR反应体系中，进行PCR扩增；
[0030]三、PCR产物经1 %琼脂糖凝胶电泳检测；
[0031]四、对扩增片段进行分析：在653bp和313bp位置有两条扩增条带，表示样品为阳 性，待检测样品中同时含有空肠弯曲杆菌和结肠弯曲杆菌。
[0032]【具体实施方式】三:本实施方式与【具体实施方式】二不同的是:PCR扩增的PCR体系如 下：
[0034] PCR扩增条件:95°C预变性5min; 95°C变性30s，52°C退火30s，72°C延伸30s，30个循 环，最后72°C延伸5min。
[0035] 其它与【具体实施方式】二相同。
[0036]本
【发明内容】
不仅限于上述各实施方式的内容，其中一个或几个【具体实施方式】的组 合同样也可以实现发明的目的。
[0037] 通过以下实施例验证本发明的有益效果：
[0038] 实施例1
[0039] 1材料和方法 [0