基于滚环扩增技术的检测半乳糖的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物化学、分子生物学、糖类成分确认的检测方法，具体涉及一种基于 滚环扩增技术的检测半乳糖的方法。
【背景技术】
[0002] 半乳糖是自然界生物体内存在的一种重要的单糖，是生物体重要的营养物质之 一，在体内是糖蛋白糖链的组成之一，也存在于日常生活的很多的奶制品中，包括食品、饮 料、保健品、微生物发酵产品等。
[0003] 半乳糖与健康关系密切，半乳糖血症（galactosemia)是半乳糖相关的一种常见 的常染色体隐形遗传的遗传代谢病（inheritedmetabolicdisorders,IMD)，是半乳糖代 谢相关酶缺陷引起的血中半乳糖浓度增尚，从而造成多器官受损的的中毒性临床代谢综合 征。该病患者多为婴幼儿，进食含乳糖的奶制品后，血液和尿液中的半乳糖浓度升高，可出 现呕吐、腹泻、嗜睡等症状，半乳糖聚集于各组织中造成多器官受累，引起包括低血糖、肝硬 化、蛋白尿、白内障、智力障碍等症状，严重可至肝衰竭、感染乃至死亡。虽然该病病情危害 严重，但是及早发现并给与积极干预措施，能够显著改善预后效果。因此，准确诊断技术对 于半乳糖血症的预防和治疗十分重要，而该病的定性诊断有赖于血中半乳糖浓度的测定。
[0004] 检测半乳糖的常用方法有高压液相（HPLC)、液相串联质谱（LC-MS/MS)、傅里叶变 换远红外光谱（FTIR)等分析化学方法。虽然这些方法有较高的检测准确性和检测灵敏度， 但是需要分离纯化等样品处理设备，而且所需的专业大型仪器不易普及。生物学方法有细 菌抑制试验，包括Guthrie法利用转移酶活性缺陷株大肠杆菌，以及Paigen法结合菌体 裂解大肠杆菌，用来检测半乳糖的含量，然而变异菌株易产生不稳定结果，而且细菌培养耗 时费力。
[0005] 此外，对于半乳糖血症，虽然还可以通过酶学和基因检测，进行突变诊断，然而，现 有的酶学检测尚不能进行有效的信号扩增，易受干扰，而且基因诊断费用较高，众多的突变 位点也造成了其诊断的不确定性。因此，开发一种新的便捷、快速、准确的检测半乳糖的方 法，对于半乳糖血症的快速诊断、食品安全监测、食品化工生产等领域都有重要意义。
【发明内容】
[0006] 本发明针对上述现存的技术问题而提出一种基于滚环扩增技术的全新的检测半 乳糖的方法，该方法原理是结合半乳糖操纵子的阻遏蛋白和滚环扩增，通过该方法可以实 现半乳糖的简便、快捷、可定量的检测。
[0007] 本发明是通过以下技术方案实现的：
[0008] -种基于滚环扩增技术的检测半乳糖的方法，其特征在于：首先制备出由环形单 链模板DNA与线性单链引物DNA所形成的双链结构，该双链含有半乳糖阻遏蛋白的识别结 合序列，待检测的半乳糖与半乳糖阻遏蛋白结合，结合了半乳糖的半乳糖阻遏蛋白失去了 识别并结合由环形单链模板DNA与线性单链引物DNA形成的双链上的特异性识别序列的能 力，不能与该特异性识别序列结合，使DNA聚合酶能够对线性单链引物DNA进行延伸和滚环 扩增，滚环扩增反应的效率与半乳糖的浓度成正比，通过比对半乳糖浓度与滚环扩增效率 的标准曲线，从而确定出待测样品中的半乳糖含量。
[0009] 所述的待检测的半乳糖是半乳糖溶液，浓度为1~50μM。
[0010] 所述的半乳糖阻遏蛋白是细菌产生的具有调控半乳糖操纵子表达活性的半乳糖 阻遏蛋白，该半乳糖阻遏蛋白能够特异性地结合半乳糖，并发生构象变化，降低了与半乳糖 操纵子识别序列结合的亲和力。
[0011] 所述的环形单链模板DNA，是作为扩增模板用于滚环扩增的单链DNA，并含有半乳 糖阻遏蛋白的识别序列。
[0012] 所述的线性单链引物DNA，含有半乳糖阻遏蛋白的识别序列，该线性单链引物DNA 序列与环形单链模板DNA的序列碱基具有序列互补性，两者形成的DNA双链能够被半乳糖 阻遏蛋白特异性地识别并结合。
[0013] 所述的DNA聚合酶是用于滚环扩增的DNA聚合酶。
[0014] 与传统的HPLC、质谱、生物学等方法相比，本发明具有如下优点：
[0015] 1、操作简单、步骤简便；
[0016] 2、不需专业的大型仪器设备。
【附图说明】
[0017] 图1是本发明的流程图；
[0018] 图2是本发明检测半乳糖的原理示意图；
[0019] 图3为本发明定量测定不同浓度半乳糖的实验结果；
[0020] 图4是本发明特异性鉴别半乳糖和其他14种单糖或二糖的实验结果。
[0021] 图2中，1、含有半乳糖阻遏蛋白识别序列的单链模板DNA;2、含有半乳糖阻遏蛋白 识别序列的线性单链引物DNA;3、DNA聚合酶；4、结合半乳糖的半乳糖阻遏蛋白；5、半乳糖； 6、未结合半乳糖的半乳糖阻遏蛋白。
[0022] 图3是本发明定量测定不同浓度半乳糖的实验结果。左图：不同浓度的半乳糖的 滚环扩增反应的荧光时间曲线，其中X轴表示时间，y轴表示荧光强度；右图：半乳糖浓度和 滚环扩增速率的线性关系，其中X轴表示半乳糖浓度，y轴表示滚环扩增速率。半乳糖浓度 单位μΜ表示微摩尔/升。
[0023]图4是本发明特异性鉴别半乳糖和其他14种单糖或二糖的实验结果。该柱状图 y轴表示相对滚环扩增速率。X轴表示14种待测糖类的名称：半乳糖、木糖、核糖、脱氧核 糖、阿拉伯糖、岩藻糖、异丙基硫代半乳糖苷、葡萄糖、果糖、山梨醇、乳糖、蔗糖、海藻糖、麦 芽糖、密二糖。
【具体实施方式】
[0024] 下面结合附图和实施例详细描述本发明。
[0025] 本发明基于滚环扩增的半乳糖的检测方法包括下述步骤：待检测的半乳糖与半乳 糖阻遏蛋白结合，降低半乳糖阻遏蛋白对环形模板中识别序列的亲和力，从环形单链模板 DNA与线性单链引物DNA形成的DNA双链上脱落，进而解除DNA聚合酶对环形单链模板DNA 和线性单链引物DNA的扩增的抑制。滚环扩增的速率与半乳糖的浓度成正比，通过制备一 系列不同半乳糖浓度与相应滚环扩增速率的标准曲线，以及测定待测样品对滚环扩增的速 率，可以分析出待测样品中的半乳糖的浓度。该方法包括待检测的半乳糖、半乳糖阻遏蛋 白、环形单链模板DNA、线性单链引物DNA、DNA聚合酶以及滚环扩增所需的酶反应体系。其 中，待检测的半乳糖是半乳糖溶液。半乳糖阻遏蛋白是细菌产生的具有调控半乳糖操纵子 表达活性的半乳糖阻遏蛋白（GalR)。该蛋白可以特异的结合半乳糖，进而发生变构，降低对 半乳糖操纵子中识别序列的亲和力。环形单链模板DNA，是作为扩增模板用于滚环扩增的环 形单链DNA，并含有半乳糖阻遏蛋白的特异识别序列。线性单链引物DNA，含有半乳糖阻遏 蛋白的特异识