用于肝癌早期预警和筛查的试剂盒的利记博彩app
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学（肿瘤筛查）领域，具体涉及一种可用于肝癌早期预警和 筛查的技术。
【背景技术】
[0002] 人原发性肝细胞癌（hepatocellularcarcinoma,HCC)指肝细胞或肝内胆管细胞 发生的癌，为我国常见恶性肿瘤之一，其死亡率在消化系统恶性肿瘤中列第三位，仅次于 胃癌和食管癌。我国约有1. 2亿乙型肝炎表面抗原携带者，每年约有300万人可能从急性 乙型肝炎发展为慢性肝炎，死于肝病30万人，其中12万人死于HCC，在我国，乙型肝炎病 毒和丙型肝炎病毒感染是导致发展原发性肝癌（HCC)的最直接原因，大多数肝癌患者的发 病进展过程表现为慢性肝炎（chronichepatitis,CH)、肝硬化（livercirrhosis,LC)到 HCC的发展进程。而在全世界每年新发现的肝癌病人中，其中就有42. 5%发生在中国，因此 中国是一个肝癌大国。对于肝癌患者来说早期手术治疗是根本的方法。目前早期对小肝癌 行肝叶切除，可有根治的希望。然而诊断较晚，事实上80%以上肝癌患者被诊断时肿瘤已进 入中晚期而失去手术机会。
[0003] 通过临床研究表明，肝癌发现得越早，治疗效果越好，能提高病人的预后及存活 率，因此早期预警筛查则显得尤其重要。然而，目前临床上早期筛查HCC的主要指标是血清 甲胎蛋白（alpha-fetoprotein,AFP)水平和影像学B超监测，但是一部分HCC患者血清AFP 长期保持低水平（<20ng/ml)，而B超在检测和进一步判断结节的特征时有一定的局限性， 从而影响到肝癌早期诊断的灵敏性。但目前临床上未有十分有效的早期检测方法，因此建 立高灵敏，经济，简便的分子技术筛查方法尤为重要。
[0004] 研究表明，肝细胞癌组织中存在多种肿瘤相关基因CpG岛的甲基化，构成其独特 的甲基化谱，成为肝细胞癌的表观遗传标志，且在肿瘤发生的癌变前阶段中，肿瘤相关因子 启动子甲基化异常在肿瘤发生发展中起重要作用。有研究认为，部分抑癌基因的异常甲基 化在正常肝和慢性肝炎阶段未发现，肝硬化（livercirrhosis，LC)开始出现，到HCC阶段 有累加的趋势，而部分癌基因则与之相反，正常肝和慢性肝炎阶段至HCC阶段甲基化程度 逐渐降低，这为肿瘤的早期诊断提供新的干预靶点。
[0005]RASSF相关区域家族 1A基因（ras-associationdomainfamily1A,RASSF1A)是 定位于肿瘤高频杂合性丢失区域3p21. 3位点的抑瘤基因，编码一个微管相关蛋白。该基 因在多种实体瘤组织中因启动子高甲基化而表达沉默，是迄今为止在肿瘤组织中甲基化 程度最高的基因之一。pl6基因又叫MTS(multipletumorsuppressor1)基因，这是一种 细胞周期中的管家基因，直接参予细胞周期的调控，负调节细胞增殖及分裂，检测P16基因 有无改变对判断患者肿瘤的易感性以及预测肿瘤的预后，具有十分重要的临床意义。胚肝 血影蛋白（embryonicliverfodrin，ELF)是一种新发现的β血影蛋白（β-Spectrin)， 在TGF-β信号通路中与Smad3/4相互作用，缺失ELF则Smad3/4不能定位。文献报道，抑癌 基因ELF在正常肝组织中表达，而肝癌干细胞及肝癌组织中表达下调，并且在敲除ELF基因 的小鼠中，40%自发产生肝癌，表明ELF在肝癌发生的早期发挥重要作用，但ELF在肝癌组 织中表达下调的原因尚未明确。细胞因子信号转导负调控因子（suppressorsofcytokine signaling，S0CS)家族是1997年以来被发现的JAK/STATs途径负性调节因子，包括CIS和 S0CS1-7共8个成员，结构相似，由N区、中央区SH2结构域和C端SOCSbox盒组成，S0CS3 是调节机体诸多细胞因子信号的重要调控分子，在发育、免疫、肿瘤发生、代谢等许多生理 调节过程中具有重要作用。SFRP1属于SFRP(secretedfrizzled-relatedprotein)基因 家族，为Wnt/frizzled信号的胞外调节物，通过与Wnt反应或直接与frizzled反应而调节 Wnt信号的传导，具有调节凋亡，在胚胎形成和肿瘤发生等多种生物学过程中发挥重要作 用的功能，称为分泌型凋亡相关蛋白（SARP)。基因组重复序列LINE1(longinterspersed nuclearelements)是一种分布在人类基因组内的内源性的易变基因序列。研究报道，大 约有4X105的LINE1重复拷贝存在于人类基因组，它们占据整个人类基因组的5%。LINE1 启动子甲基化会抑制反转座子激活和转录，所以L1的甲基化程度可以作为衡量基因组稳 定性和癌基因活跃程度的标志之一。
[0006] 正常人循环血液中存在少量游离DNA(约10ng/ml)，而肿瘤患者血浆DNA水平远远 高于正常人（超过l〇〇ng/ml)。肿瘤患者循环血中游离DNA主要是肿瘤细胞凋亡或组织坏 死后释放，并且保持有肿瘤细胞DNA的生物学特征改变。检测外周血游离DNA中基因甲基 化的状态可能反应出患者肿瘤细胞的甲基化状态。鉴于理想的分子标志物出现在疾病发生 的早期含量较低，所以迫切需要寻找高灵敏度和无创性的早期检测手段。
[0007] 甲基化是蛋白质和核酸一种重要的修饰，调苄基因的表达和关闭，与癌症、衰老、 老年痴呆等许多疾病密切相关，是表观遗传学的重要研究内容之一。DNA甲基化是指生物 体在DNA甲基转移酶（DNAmethyltransferase，DMT),以s-腺苷甲硫氨酸（SAM)为供体， 将甲基转移到待定的碱基上的过程。他能通过结合甲基化结合域（MBD)等和组蛋白去乙酰 化能引起基因的表达沉默，在肿瘤形成中，DNA甲基化紊乱可表现为基因组整体的低甲基化 (hypomethylation)以及特定区域（如启动子区域）高甲基化。而研究结果提示亚硫酸氢 盐能使DNA中未发生甲基化的胞嘧啶（C)脱氨基转变成尿嘧啶（U)，而甲基化的胞嘧啶保 持不变。由于尿嘧啶与胸腺嘧啶（T)相似，在DNA聚合反应过程中可以作为胸腺嘧啶，根据 修饰后的差异DNA设计PCR引物，当进行PCR反应时，在扩增后的产物中变成胸腺嘧啶，而 5-甲基胞嘧啶在亚硫酸氢盐处理过程中不发生改变，经PCR扩增后的产物依然是胞嘧啶， 最后对PCR产物进行分析就可判断CpG位点是否发生甲基化。
[0008]复合扩增基因座技术（multiplexploymerasechainreaction,m-PCR)也称多 重PCR，是用多对引物同时对模板DNA上的多个区域进行扩增。一般PCR仅应用一对引物， 通过PCR扩增产生一个核酸片段；多重PCR是在同一PCR反应体系里加上多对引物，同时 扩增出多个核酸片段的PCR反应，其反应原理，反应试剂和操作过程与一般PCR相同。多重 PCR扩增体系中包含有化学修饰热启动Taq酶的MasterMix，可避免由非特异性扩增和引 物二聚体引起的非特异性产物的形成，适用于50-1500bp、多达30对引物的多重PCR扩增， 对不同的引物对能保证相近的扩增效率，可处理不同长度和GC含量的片段。它的特点主要 有三点：①高效性，在同一PCR反应管内对有多个型别的目的基因进行分型②经济性，可最 大限度的节省检材用量及试剂消耗。③简便性，多个基因在同一反应管内同时检出，将大大 的节省时间，为临床提供更多更准确的诊断信息。而本专利中主要用于RASSFlA、pl6、ELF、 S0CS3、SFRP1、LINE1六基因的甲基化反应，而PCR产物检测方法主要有两种一PAGE银染和 毛细管电泳。
[0009]PAGE(Polyacrylamidegelelectrophoresis)即聚丙稀酰胺凝胶电泳，是以聚丙 烯酰胺凝胶作为支持介质的一种常用电泳技术。用于分离蛋白质和寡核苷酸。其原理是因 为聚丙烯酰胺凝胶为网状结构，具有分子筛效应。它有两种形式：非变性聚丙烯酰胺凝胶电 泳（Native-PAGE)及SDS-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE);该技术选用非变性聚丙烯酰胺凝 胶，其在电泳的过程中，PCR产物能够保持完整状态，并依据其分子量大小、形状及其所附带 的电荷量而逐渐呈梯度分开。银染显色中，在碱性条件下，用甲醛将蛋白带上的硝酸银（银 离子）还原成金属银，以使银颗粒沉积在PCR产物带上，染色的程度与基团有关。
[0010] 毛细管电泳是以弹性石英毛细管为分离通道，以高压直流电场为驱动力，依据样 品中各组分之间淌度和分配行为上的差异而实现分离的电泳分离分