一种基于磁珠法的动物组织dna提取试剂盒及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，涉及一种基于磁珠法的动物组织DNA提取试剂盒，可 应用于多个物种动物组织DNA提取，也可应用于同个物种不同组织的DNA提取。本发明还 涉及应用该试剂盒从动物组织样本中提取DNA的方法。
【背景技术】
[0002] 真核生物基因组DNA广泛应用在动植物的遗传育种、基因图谱的构建、品种鉴定、 物种形成和系统演化等方面的研究中。无论是基因工程还是蛋白质工程，核酸分子都是这 些技术应用所涉及的主要对象，所以DNA的分离与提取是分子生物学研究中重要的基本技 术。
[0003] 目前对于动物全基因组DNA的提取已有很多的研究和报道，但是选取何种方法能 够更有效地提取更高质量的基因组DNA，还是一个值得解决的问题。动物DNA的提取通常采 用经典提取方法，即酚抽提法、异丙醇沉淀法以及甲酰胺裂解法，后来许多方法的改进都是 在这三种方法的基础上进行的。这三种方法均利用蛋白酶K和十二烷基硫酸钠（SDS)消化 破碎细胞。采用上述经典方法获得的DNA纯度很高，能够满足各种实验的要求，但操作繁琐 且用时长，还需要用到多种仪器设备。
[0004] 相比传统的DNA提取方法，以磁珠为载体的新型分离技术，无需大量检材，也无需 接触酚/氯仿等有毒试剂，且操作简单方便，很容易实现自动化操作，基于磁珠法的核酸提 取具备传统DNA提取无法比拟的优势，是未来核酸提取发展的重要方向。鉴于DNA提取的 技术现状与发展前景，需要研发多种基于磁珠法的新型DNA提取试剂盒。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于克服现有DNA提取技术的不足，提供了一种基于磁珠法的动物 组织DNA提取试剂盒及其应用，该技术方案将磁珠法与传统的动物DNA提取中的裂解液相 结合，具有操作简单快速、使用安全、提取效率高、实现成本低的特点。为了实现上述技术目 的，本发明试剂盒的技术方案为： 一种动物组织DNA提取的试剂盒，试剂包括裂解液、结合液、洗涤液和核酸洗脱液，所 述洗涤液包括洗涤液I、洗涤液II和洗涤液III;所述裂解液含有十二烷基硫酸钠、乙二胺四 乙酸、三羟甲基氨基甲烷、氯化钠和曲拉通X-100 ;所述结合液含有异丙醇；所述洗涤液I 含有盐酸胍、乙二胺四乙酸、三羟甲基氨基甲烷、氯化钠和异丙醇；所述洗涤液II含有乙酸 钠和异丙醇；所述洗涤液III含有异丙醇；所述核酸洗脱液含有三羟甲基氨基甲烷。
[0006] 优选地，在所述裂解液中，十二烷基硫酸钠的浓度为0. 5%-3% (m/v)，乙二胺四 乙酸的浓度为10_40mmol/L，三轻甲基氨基甲烧的浓度为10-40mmol/L，氯化钠的浓度为 l-5mol/L，曲拉通X-100的浓度为0. 5%-3% (v/v)，余量皆为去离子水；使用氢氧化钠和盐 酸调节所述裂解液的pH值为7. 0-9. 0。更为优选地，所述十二烷基硫酸钠的浓度为2% (m/ v)，所述乙二胺四乙酸的浓度为20mmol/L、所述三羟甲基氨基甲烷的浓度为20mmol/L，所 述氯化钠的浓度为1. 4mol/L，所述曲拉通X-100的浓度为1% (v/v)，裂解液的pH值调节为 8. 0〇
[0007] 优选地，在所述结合液中，所述异丙醇为分析纯，浓度大于99. 9%。
[0008] 优选地，在所述洗涤液I中，盐酸胍的浓度为2-10m〇l/L，乙二胺四乙酸的浓度为 10-40mmol/L，三羟甲基氨基甲烷的浓度为10-40mmol/L，氯化钠的浓度为l-5mol/L，异丙 醇的浓度为50%-70% (v/v)，余量皆为去离子水；使用氢氧化钠和盐酸调节所述所述洗涤液 I的pH值为7. 0-9. 0。更为优选地，所述盐酸胍的浓度为5mol/L，所述乙二胺四乙酸的浓 度为20mmol/L，所述三轻甲基氨基甲烧的浓度为20mmol/L，所述氯化钠的浓度为1. 4mol/ L，所述异丙醇的浓度为50% (v/v)，洗涤液I的pH值调节为8. 0。
[0009] 优选地，在所述洗涤液II中，乙酸钠的浓度为l_5m〇l/L，异丙醇的浓度为50%-80% (v/v)。更为优选地，所述乙酸钠的浓度为5mol/L，所述异丙醇的浓度为80% (v/v)。
[0010] 优选地，在所述洗涤液III中，异丙醇的浓度为50%-100% (v/v)。更为优选地，所述 异丙醇的浓度为80% (v/v)。
[0011] 优选地，在所述核酸洗脱液中，三轻甲基氨基甲烧的浓度为l-4mmol/L;使用氢氧 化钠和盐酸调节所述核酸洗脱液的pH值为7. 0-9. 0。更为优选地，所述三羟甲基氨基甲烷 的浓度为2mmol/L，所述核酸洗脱液的pH值调节为8. 0。
[0012] 本发明还提供两种上述试剂盒的应用方法，方法一的技术方案为，包括如下步 骤： ① 在EP管中加入动物组织、裂解液和蛋白酶K并匀浆，于56°C水浴孵育30分钟后离 心； ② 离心后的上清液转移至新的EP管中，加入磁珠和结合液，结合时间10分钟； ③ 使用磁铁将磁珠吸附至管壁，弃去EP管内所有液体； ④ 在EP管中加入洗涤液I，混匀后，使用磁铁将磁珠吸附至管壁，弃去管内所有液体； ⑤ 在EP管中加入洗涤液II，混匀后，使用磁铁将磁珠吸附至管壁，弃去管内所有液体； ⑥ 在EP管中加入洗涤液III，混匀后，磁铁将磁珠吸附至管壁，弃去管内所有液体。
[0013] ⑦在EP管中加入核酸洗脱液，于56 °C水浴下洗脱5分钟，使用磁铁将磁珠吸附至 管壁，将洗脱液转移至新的EP管内，在-20 °C保存备用； 其中：步骤①中加入的裂解液与动物组织的体积质量比为30μL:lmg-6μL:lmg;步骤 ②中加入的磁珠与结合液的体积比为1:10-1:20 ;步骤④、⑤、⑥中加入的洗涤液I、洗涤 液II、洗涤液III分别与裂解液的体积比为1:1-3:1 ;步骤⑦中加入的核酸洗脱液与裂解液 的体积比为1:1-1: 5。作为更佳的组成，裂解液与动物组织的体积质量比为6μL:lmg，磁珠 与结合液的体积比为1:15优选的，三种洗涤液与裂解液的体积比分别为2:1，核酸洗脱液 与裂解液的体积比为1:3。
[0014] 优选地，所述EP管容量为2mL，加入的试剂为：10yL浓度20mg/mL的蛋白酶K，动 物组织50mg，裂解液300μL，磁珠20μL，结合液300μL，洗涤液I、洗涤液II和洗涤液III各 600μL，核酸洗脱液100μL。
[0015] 方法二的技术方案为，包括如下步骤： ① 96孔反应板1排加入结合液； ② 所述96孔反应板2排加入磁珠和去离子水； ③ 所述96孔反应板3排加入洗涤液I; ④ 所述96孔反应板4排加入洗涤液II; ⑤ 所述96孔反应板5排加入洗涤液III; ⑥ 所述96孔反应板6排加入核酸洗脱液； ⑦ 在EP管中加入动物组织、裂解液和蛋白酶K，匀浆后直接离心，将上清液转移至所述 96孔反应板1排，所述96孔反应板放入核酸提取仪后开始运行，结束后将所述96孔反应板 6排中的核酸洗脱液转移至新的EP管内，在-20°C保存备用； 其中：所述96孔反应板单孔内的液体总体积小于1.OmL，所述EP管容量为2mL;步 骤①中加入的结合液为50-200μL;步骤②中加入的磁珠为20-100μL，且用300-600μL 去离子水与其混匀；步骤③、④、⑤中加入的洗涤液I、洗涤液II和洗涤液III分别为 500μL-700μL;步骤⑥中加入的核酸洗脱液为50-300μL;步骤⑦中加入的裂解液为 200μL-300μL，动物组织为10-50mg。作为更佳的组成，结合液与裂解液的体积比为2: 3， 三种洗涤液与裂解液的体积比分别为2:1，核酸洗脱液与裂解液的体积比为1:3,裂解液的 与动物组织的体积质