属于GH3家族的耐热性β-木糖苷酶的利记博彩app
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种耐热性β-木糖苷酶、编码上述耐热性β-木糖苷酶的多核苷酸、 用于表达上述耐热性β-木糖苷酶的表达载体、整合了上述表达载体的转化体、以及使用 上述耐热性β-木糖苷酶的木质纤维素分解产物的制备方法。
[0002] 本申请要求基于2014年9月17日在日本申请的特愿第2014-189007号的优先权， 并在本文中引用其内容。
【背景技术】
[0003] 除了对运输用能源供应的担忧之外，由于全球变暖和大气污染等环境上的问题， 近年来，石油替代能源的开发成为非常重要的课题。植物生物质是地球上最丰富的可再生 能源，作为石油替代资源而备受期待。作为植物生物质的主要成分的木质纤维素为纤维素、 半纤维素（包含木聚糖、阿拉伯聚糖和甘露聚糖）等多糖类，以及木质素。这些多糖类被各 种糖苷水解酶水解为葡萄糖或木糖等单糖后，用作生物燃料或化学品原料。
[0004] 具有复杂结构的木质纤维素是难分解性的，难以用单一的酶分解或糖化 (hydrolysis)。因此，对于多糖类中的纤维素的水解，通常需要糖苷水解酶中的内切葡聚糖 酶（内切-1，4-β-D-葡聚糖酶，EC3. 2. 1. 4)、外切型纤维二糖水解酶（1，4-β-纤维二糖糖 苷酶（cellobiosidase)或纤维二糖水解酶，EC3. 2. 1. 91、EC3. 2. 1. 176)、β-葡糖苷酶 (EC3. 2. 1. 21)这三种酶。另一方面，半纤维素的构成因植物的种类而异，例如，在阔叶树和 草本植物中，木聚糖构成了主要成分。对于木聚糖的水解，需要木聚糖酶（内切-1，4-β-木 聚糖酶，EC3. 2. 1. 8)、β-木糖苷酶（EC3. 2. 1. 37)。β-木糖苷酶对通过木聚糖酶水解半纤 维素生成的低聚糖进行水解，是涉及单糖生成工艺的水解酶之一。
[0005] 在以往的以木质纤维素为资源的生物乙醇的制备中，以乙醇的高能效转化为目 的，尝试了基于高固液比（30~60%的固液比）的糖化处理（hydrolysisprocess)。这种 基于高固液比的木质纤维素的酶糖化，生物质糖化液的粘性高，难以进行木质纤维素的水 解反应。因此，通过使用耐热性酶在例如80°C以上的高温下进行酶解糖化处理，除了加快水 解反应速度之外，降低了生物质糖化液的粘性，从而有望实现缩短糖化反应时间并降低酶 量。因此，对于各种糖苷水解酶，期望开发耐热性更优异的酶。
[0006] 大多数耐热性糖苷水解酶可以通过如下方式获得：对生存于高温环境下的嗜热性 微生物进行分离鉴定，从这些分离培养的微生物中克隆基因，确定DNA序列后，利用大肠杆 菌或丝状真菌等表达而获得。例如，专利文献1公开了来源于丝状真菌的β-木糖苷酶，专 利文献2公开了在30°C表现出酶活性的、来源于丝状真菌米曲霉（Aspergillusoryzae)的 β-木糖苷酶。专利文献3中公开了在pH5. 5以下、50°C以上表现出酶活性的、来源于酸热 脂环酸芽孢杆菌（Alicyclobacillusacidocaldarius)的β-木糖苷酶。专利文献4公开 了在45°C表现出酶活性的、来源于解纤维顶孢霉（Acremoniumcellulolyticus)的β-木 糖苷酶。另外，非专利文献1~6报道了最适温度为60°C左右的、分离自特定细菌或丝状真 菌的β-木糖苷酶。
[0007] 现有技术文献
[0008] 专利文献
[0009] 专利文献1 :特表平第11-507837号公报
[0010] 专利文献2 :特开平第11-313683号公报
[0011] 专利文献3 :特表第2011-523346号公报
[0012] 专利文献4 :特开第2013-59272号公报
[0013] 非专利文献
[0014] 非专利文献 1:Kormelink等，《JournalofBiotechnology(生物技术杂志）》， 1993 年，第 27 卷，第 249-265 页。
[0015] 非专利文献 2:Herrmann等，《BiochemicalJournal(生化杂志）》，1997 年，第 321 卷，第375-381页。
[0016] 非专利文献 3:kitamoto等，《AppliedandEnvironmentalMicrobiology(应用 与环境微生物学）》，1999年，第65卷，第20-24页。
[0017]非专利文献 4:LaGrange等，《AppliedandEnvironmentalMicrobiology(应用 与环境微生物学）》，2001年，第67卷，第5512-5519页。
[0018] 非专利文献 5:Shao等，《AppliedandEnvironmentalMicrobiology(应用与环 境微生物学）》，2011年，第77卷，第719-726页。
[0019] 非专利文献 6:Morais等，《JournalofBiologicalChemistry(生物化学杂 志）》，2012年，第287卷，第9213-9221页。
【发明内容】
[0020] 本发明要解决的技术问题
[0021] 本发明的目的是提供一种至少在80°C且pH4.0的条件下表现出以对硝基苯 基-β-D-吡喃木糖苷（下文有时缩写为PNPX)为底物的水解活性的新耐热性β-木糖苷 酶、编码上述耐热性β-木糖苷酶的多核苷酸、用于表达上述耐热性β-木糖苷酶的表达载 体、整合了上述表达载体的转化体、以及使用上述耐热性β-木糖苷酶制备木质纤维素分 解产物的方法。
[0022] 解决技术问题的技术手段
[0023] 本发明的发明人为了解决上述问题，通过从温泉高温土壤中直接提取DNA来进行 难培养微生物群的大规模宏基因组测序，成功获取具有新的氨基酸序列的耐热性β-木糖 苷酶，从而完成本发明。
[0024] S卩，作为本发明的耐热性木糖苷酶、多核苷酸、表达载体、转化体、耐热性 β-木糖苷酶的制备方法、糖苷水解酶混合物、以及木质纤维素分解产物的制备方法，可以 列举下列[1]~[10]。
[0025] [1] -种耐热性β_木糖苷酶，其具有由下列⑷、⑶或（C)构成的β_木糖苷 酶催化区域：
[0026] (Α)由序列号1、3或5所示氨基酸序列构成的多肽；
[0027] (Β)由序列号1、3或5所示氨基酸序列中的至少一个氨基酸的缺失、取代或添加而 形成的氨基酸序列所构成、并且至少在80°C且ρΗ4. 0的条件下具有以对硝基苯基-β-D-吡 喃木糖苷为底物的水解活性的多肽；
[0028] (C)由与序列号1、3或5所示氨基酸序列具有80%以上序列一致性的氨基酸序列 所构成、并且至少在80°C且pH4. 0的条件下具有以对硝基苯基-β-D-吡喃木糖苷为底物的 水解活性的多肽。
[0029] [2]上述[1]的耐热性β-木糖苷酶，其进一步具有β-葡糖苷酶活性。
[0030] [3] -种多核苷酸，其具有由下列（a)~（e)的碱基序列构成的编码β-木糖苷酶 催化区域的区域：
[0031] (a)编码由序列号1、3或5所示氨基酸序列构成的多肽的碱基序列；
[0032] (b)编码由序列号1、3或5所示氨基酸序列中的至少一个氨基酸的缺失、取代或 添加而形成的氨基酸序列所构成的、并且至少在80°C且pH4. 0的条件下具有以对硝基苯 基-β-D-吡喃木糖苷为底物的水解活性的多肽的碱基序列；
[0033] (c)编码由与序列号1、3或5所示氨基酸序列具有80%以上序列一致性的氨基酸 序列构成的、并且至少在80°C且ρΗ4. 0的条件下具有以对硝基苯基-β-D-吡喃木糖苷为底 物的水解活性的多肽的碱基序列；
[0034] (d)与序列号2、4或6所示碱基序列具有80%以上序列一致性、并且编码至少在 80°C且pH4. 0的条件下具有以对硝基苯基-β-D-吡喃木糖苷为底物的水解活性的多肽的 喊基序列；
[0035] (e)与由序列号2、4或6所示碱基序列构成的多核苷酸在严格条件下进行杂交的 多核苷酸的碱基序列、且编码至少在80°C且pH4. 0的条件下具有以对硝基苯基-β-D-吡喃 木糖苷为底物的水解活性的多肽的碱基序列。
[0036] [4]上述[3]的多核苷酸，上述多肽进一步具有β-葡糖苷酶活性。
[0037] [5] -种表达载体，其整合了上述[3]或[4]的多核苷酸，在宿主细胞中可表达具 有β-木糖苷酶活性的多肽。
[0038] [6] -种转化体，其导入有上述[5]的表达载体。
[0039] [7]上述[6]的转化体，其为真核微生物。
[0040] [8]上述耐热性β-木糖苷酶的制备方法，其包括在上述[6]或[7]的转化体中生 产上述耐热性β-木糖苷酶。
[0041] [9] -种糖苷水解酶混合物，其包含上述[1]或[2]的耐热性β-木糖苷酶、上述 [3]或[4]的多核苷酸编码的耐热性β-木糖苷酶、或者利用上述[8]的耐热性β-木糖苷 酶的制备方法制得的耐热性β-木糖苷酶、以及至少一种其他糖苷水解酶。
[0042] [10] -种木质纤维素分解产物的制备方法，其包括使含有纤维素、半纤维素及木 质素的木质纤维素所形成的材料与上述[1]或[2]的耐热性木糖苷酶、上述[3]或[4] 的多核苷酸编码的耐热性β-木糖苷酶、上述[6]或上述[7]中记载的转化体、利用上述
[8]的耐热性β-木糖苷酶的制备方法制得的耐热性β-木糖苷酶、或者上述[9]的糖苷水 解酶混合物接触，由此生产木质纤维素分解产物。
[0043] 发明效果
[0044] 本发明的耐热性β-木糖苷酶至少在80°C且ρΗ4.0的条件下具有以对硝基苯 基-β-D-吡喃木糖苷（下文有时缩写为PNPX)为底物的水解活性。因此，上述耐热性β-木 糖苷酶适合于高温条件下的、由木质纤维素所形成的材料、例如由含有半纤维素或纤维素 的木质纤维素所形成的材料的糖化处理（hydrolysisprocess)。
[0045] 此外，作为另一方面，上述耐热性木糖苷酶适合于高温条件下的、包含具有 β-木糖苷键的化合物、优选包含具有β-木糖苷键的低聚糖的材料的糖化处理。
[0046] 此外，作为又一方面，上述耐热性β-木糖苷酶适合于高温条件下的、包含具有 β-糖苷键的化合物、优选包含具有β-糖苷键的低聚糖的材料的糖化处理。
[0047] 此外，本发明的多核苷酸、整合了上述多核苷酸的表达载体、导入有上述表达载体 的转化体适合用于制备本发明的耐热性β-木糖苷酶。
【附图说明】
[0048] 图1为β_木糖苷酶基因克隆AR19M-311-2的氨基酸序列（序列号1)与属于嗜 热网球菌（Dictyoglomusthermophilum)的GH3家族的β-木糖苷酶（序列号10)的氨基 酸序列比对图。
[0049]图2为开放阅读框AR19M-311的氨基酸序列（序列号1)、AR19M-311-2蛋白的氨 基酸（序列号3)和AR19M-311-11蛋白的氨基酸序列（序列号5)的氨基酸序列比对图。
[0050] 图3Α为表示实施例1中的AR19M-311-2基因在大肠杆菌中表达得到的 AR19M-311-2蛋白的SDS-PAGE分析结果的图。
[0051] 图3Β为表示实施例1中的AR19M-311-11基因在大肠杆菌中表达得到的 AR19M-311-11蛋白的SDS-PAGE分析结果的图。
[0052] 图4为表示实施例1中的大肠杆菌所表达的AR19M-311-2蛋白对各底物的水解活 性的测定结果的图。
[0053] 图5为表示实施例1中的大肠杆菌所表达的AR19M-311-2蛋白在各温度下的ΡΝΡΧ 水解活性（ΡΗ4.0)的测算结果的图。
[0054] 图6为表示实施例1中的大肠杆菌所表达的AR19M-311-2蛋白在各pH的ΡΝΡΧ水 解活性（70°C)的测算结果的图。
[0055] 图7A为表示实施例1中的大肠杆菌所表达的AR19M-311-2蛋白示出的、伴随热变 性而引发的SYPR0Orange(宝石橙蛋白染色试剂）的荧光强度变化实测值的图。
[0056] 图7B为表示实施例1中的大肠杆菌所表达的AR19M-311-2蛋白示出的、伴随热变 性而引发的SYPR0Orange的焚光强度变化的一级微分"_d(Fluorescence)/dt"的图。
【具体实施