一种新型耐热糖苷水解酶MtCel1及其编码序列和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物工程，具体地说是一种以嗜热毁丝菌Myceliophthora thermophila的DUF4360超家族基因MtCell表达的耐热糖苷水解酶MtCell及其编码序列 和应用。 (二）
【背景技术】
[0002] 糖苷水解酶（英语：Glycosidehydrolases，又称糖苷酶）是一种专门水解配糖键 (glycosidicbond)，并产生两个较小的糖分子的酵素，也是自然界中的常见酵素之一。这 类蛋白质在人类的产业上也有所应用，例如用来将纤维素与半纤维素等生物质能降解成可 用的小分子。糖苷水解酶具有多个家族。
[0003] 嗜热毁丝菌Myceliophthorathermophila是一种广泛分布于土壤中的嗜热真菌。 该菌在微晶纤维素为唯一碳源的培养基中50°C条件下可以产生热稳定的纤维素酶和糖苷 水解酶。
[0004] 嗜热毁丝菌产生的耐热糖苷水解酶MtCell属于DUF4360超家族蛋白，具有很强的 纤维素酶活性，但之前从未发现DUF4360超家族具有水解活性的任何报道。MtCell对羧甲 基纤维素的水解活力高达18. 6U/mg，对微晶纤维素的水解活力为4. 44U/mg。 (三）
【发明内容】
[0005] 本发明从嗜热毁丝菌Myceliophthorathermophila获得耐热糖苷水解酶基因的 cDNA序列全长，命名为MtCel1，基因cDNA全长636bp，编码211个氨基酸。MtCel1具有信号 肽序列（l_16aaMRSLVNLLLLAGAAAA)及一个N糖基化位点和5个0糖基化位点。将MtCell 编码的氨基酸序列在国际基因库中进行检索，尚未发现相关报道。
[0006] 构建重组表达质粒载体pPIC9K/MtCel1，利用电转仪进行电击转化Pichia pastorisGS115,在MD和丽培养基上筛选，经PCR鉴定筛选阳性转化子，G418筛选多拷贝 转化子，然后进行甲醇诱导表达，获得毕赤酵母工程菌株GS-MT-Cell。该工程菌株接种于含 BMGY培养基中，在28°C200rpm/min摇床培养6d后，糖苷水解酶的表达量为4. 42mg/ml，分 子量为73. 8KDa，酶活力为18. 6U/mg，MtCell在60°C下是稳定的，处理60min后仍有92% 以上的酶活性；70°C处理60min后仍保持65%的活性；80°C处理60min后保持39%的活性； 90°C处理60min后保持10%。
[0007] 耐热糖苷水解酶MtCell对长链纤维素具有很强的水解能力，其对羧甲基纤维素 的水解活力高达18. 6U/mg，对微晶纤维素的水解活力为4. 44U/mg。并且MtCell有很好的 热稳定性，在70°C的处理lh条件下仍可以保持65%的活性，具有很好的工业应用前景。 (四）
【附图说明】：
[0008] 图1耐热糖苷水解酶MtCel1的SDS-PAGE分析
[0009]泳道1 :低分子量蛋白标准
[0010] 泳道2 :纯化的耐热糖苷水解酶MtCel1
[0011] 图2A:耐热糖苷水解酶MtCel1的最适温度
[0012] 图2B:耐热糖苷水解酶MtCel1的热稳定性测定
[0013] 图3耐热糖苷水解酶MtCel1的最适pH
[0014] 图4耐热糖苷水解酶MtCel1产物的TLC分析
[0015] 泳道1 :标准寡糖（DP2-DP7)
[0016] 泳道2 :水解羧甲基产物 (五）【具体实施方式】
[0017] 实施例1 :嗜热毁丝菌Myceliophthorathermophila的分离鉴定
[0018] (1)标本采集：从堆肥中采集。
[0019] (2)分离培养：将采集标本取0. 5克放置在PDA平板上50°C培养3天后，进行分离 纯化。操作步骤参考CooneyandEmerson(1964)文献。
[0020] (3)鉴定：参考CooneyandEmerson(1964)和LaTouche(1950)文献。
[0021] 实施例2 :耐热糖苷水解酶基因MtCel1的克隆
[0022] (1)嗜热毁丝菌Myceliophthorathermophila总RNA的提取：参照Trizol试剂 盒说明。
[0023] (?cDNA第一条链的合成：按照Takara公司的TaKaRaRNAPCRkit(AMV)Ver3· 0 试剂盒说明书进行：取1~2μg总RNA，加RNaseFreeddH20至9· 5μL，将RNA样品在75°C 变性5miη，立即在冰浴中冷却5miη，然后稍微离心一下，在冰浴中依次加入以下各种成 分：10mmol/LdNTPMixture2yL，10XRTBuffer(Mg2+)2yL，25mmol/LMgCl24yL，Oligo d(T)-AdaptorPrimer1μL,RNaseInhibiter0.5μL,AMVReverseTranscriptase 1yL(FinalVolume20yL)，将反应液混合后，室温下放10min，然后42°C温育60min，再煮 沸5min以灭活反转录酶。加入180μLDEPC处理的ddH20,稀释至200μL，混勾，稍微离心， 保存于-20 °C，备用。
[0024] (3)PCR反应（25yL):cDNA2yL，lOXBuffer2. 5yL，10mmol/LdNTP2yL， 25mmol/LMgC122yL，上、下游引物各 2yL，TaqDNA聚合酶 0· 5yL(5U/yL)，ddH20 12yL。 反应条件为94°C5min预变性；94°C40s，56°C40s，72°Clmin，共32个循环，72°C延伸 10min，4°C保存。
[0025]上游引物：5 ' -ATGCGCTCGCTTGTC-3 '
[0026]下游引物：5 ' -TCAGGAAGAGGAATC-3 '
[0027] (4)基因克隆：取0. 5μ1PCR产物与pMD18-T载体进行连接，操作步骤按照 TAKARA公司产品说明书进行。然后连接产物转化大肠杆菌DH5a菌株，在表面涂有氨卞青 霉素（100μg/mL)的LB平板上生长过夜。挑取白色菌落，在LB液体培养基中培养过夜。
[0028] (5)质粒DNA的提取：碱法提取质粒DNA。
[0029] (6)序列测定：DNA双脱氧法测定核苷酸序列，在上海生物工程有限公司进行。序 列引物为M13启动子引物。嗜热毁丝菌MtCel1基因cDNA全长636bp，包含起始密码子和终 止密码子，无内含子，编码211个氨基酸。将此氨基酸序列在国际基因库中进行检索，尚未 发现报道。该序列如下：
[0030] (A)SEQIDNO1 的信息
[0031] (a)序列特征：*长度：636碱基对；*类型：核酸；*链型：双链；*拓扑结构：线性
[0032] (b)分子类型：DNA
[0033] (c)假设：否
[0034] ⑷反义：否
[0035] (e)最初来源：嗜热毁丝菌Myceliophthorathermophila
[0036] (f)序列描述：
[0039] (B)SEQIDNO2 的信息
[0040] (a)序列特征：*长度：211氨基酸；*类型：氨基酸；*链型：单链；*拓扑结构：线 性
[0041] (b)分子类型：蛋白质
[0042] (c)序列描述：
[0044] 实施方式3:表达载体的构建
[0045] (1)根据分离出的MtCell基因的核苷酸序列设计表达引物，在引物的5'端分别引 入EcorI和NotI酶切