一种无血清的脐带间充质干细胞培养基的利记博彩app
【技术领域】
[0001] 本发明涉及细胞培养技术领域，具体地说是一种无血清的脐带间充质干细胞培养 基。
【背景技术】
[0002] 脐带间充质干细胞是指存在于新生儿脐带组织中的一种多能干细胞，细胞表面 强表达特异性标记⑶90,⑶73,⑶105,而不表达造血系或内皮系细胞的标记⑶45、⑶14、 ⑶11、⑶34、⑶19,低表达或不表达主要组织相容性抗原HLA-DR。研究显示，脐带间充质干 细胞具有较高的分化潜能，可向多个方向进行分化如骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、 内皮和心肌等。与骨髓间充质干细胞相比，脐带间充质干细胞含量和增殖能力均优于后者， 且免疫原性低、取材方便、无伦理学争议等优点，因此在间充质干细胞中具有更高的临床应 用价值。
[0003] 在实际临床应用中，无外源性污染和细胞数量是保证脐带间充质干细胞治疗的必 要因素。目前，脐带间充质干细胞的培养体系大都含有动物血清（如胎牛血清），一方面由 于血清中不明蛋白的存在，对细胞的信号转导和细胞表面标志形成干扰，另一方面采用添 加血清培养的干细胞进行体内移植，可能引起病原体的交叉感染，因此需要开发化学成分 明确的无血清培养基。目前，市场上存在的无血清干细胞培养基用于培养脐带间充质干细 胞培养时，一部分由于无血清培养基组成方面的不足，生长速度慢，容易出现老化的特征影 响细胞的大量扩增，一部分培养基中添加了昂贵的抗体等特殊因子，增加了脐带间充质干 细胞扩增成本。以上弊端一定程度上阻碍了脐带间充质干细胞的临床治疗应用。
【发明内容】
[0004] 本发明的技术任务是解决现有技术的不足，提供一种无血清的脐带间充质干细胞 培养基，克服血清外源性污染缺陷和细胞扩增数量与降低成本之间的矛盾问题。
[0005] 本发明的技术方案是按以下方式实现的，一种脐带间充质细胞在无血清的脐带间 充质干细胞培养基中传代培养及扩增的实验方法，该实验方法的步骤是：
[0006]( -）首先制备无血清的脐带间充质干细胞培养基，该无血清的脐带间充质干细 胞培养基包括基础培养基和添加成份；其中，基础培养基为DMEM培养基，添加成份及其含 量如下：
[0007] 碱性成纤维生长因子hFGF:l-20ng/mL;
[0008]表皮生长因子hEGF:1-20μg/mL;
[0009]胰岛素hi:1-20μg/mL;
[0010]白血病抑制因子hLIF:0·l_5ng/mL;
[0011] L-谷氨酰胺;
[0012] 2-巯基乙醇：50-200μΜ;
[0013]亚硒酸钠：20-50ηΜ;
[0014]转铁蛋白：10-30μg/mL;
[0015]人白蛋白：10_100mg/mL;
[0016]纤连蛋白：50-200μg/mL;
[0017] 黄芪多糖APS:50-200μg/mL。
[0018](二）脐带间充质细胞在上述培养基中传代培养及扩增的实验步骤是：
[0019]a.把经常规法分离所得并液氮保存的脐带间充质干细胞冻存管从液氮中取出来， 立即投入37°C水浴锅中，轻微摇动，2min内即可溶解，同时预热上述无血清的脐带间充质 干细胞培养基；
[0020] b.把经37°C解冻后的脐带间充质干细胞吸到装有9mL培养基的15mL的离心管 中，同时用培养液洗2次冻存管，一起加到离心管中吹匀，避免产生泡沫，然后250倍重力的 转速离心5分钟；
[0021] c.弃上清液，分别加2mL预热的的上述培养基，轻轻吹勾，保证细胞完全悬浮起 来；将重悬的细胞接种到T25的培养瓶中，加入适量的培养液，再把细胞摇均匀，保证所有 的细胞能够均匀的分布；
[0022] d.标好细胞种类和日期、培养基种类等，放入37 °C、5 %C02培养箱中；
[0023]e.细胞贴壁后换培养基，保证去除死细胞；
[0024] 培养皿中的细胞覆盖率达到80%~90%时按1:3的比例传代至细胞培养板中，传 代使用的生长培养基为本发明培养基；显微镜下观察脐带间充质干细胞生长状况；拍照纪 录；
[0025]f.传至第2代时，MTT法检测细胞活性绘制细胞生长曲线，具体操作：将生长至 80%融合度的第2代脐带间充质干细胞酶解悬浮，调整细胞浓度至IX104个/mL，加入24孔 板，每孔800μL，置于37°C、饱和湿度、5%的C02培养箱中培养，每隔6小时取出一份24孔 板，每孔加入80μL浓度为5g/L的MTT溶液后，37°C下放置4h，在每孔加入600μL的二甲 基亚砜DMS0,用酶标仪在550nm处测定各孔吸光光度0D值，以0D值代表细胞的相对数量， 绘制生长曲线，纪录结果；
[0026](三）培养细胞的表面标记分析的试验步骤是：
[0027] 取P2代的细胞，去掉培养液，PBS洗涤2次，用1:1的0. 05%质量浓度胰蛋白酶液 消化，l〇〇〇r/min离心5min，用PBS洗涤1次，调整细胞浓度，制成浓度为106/mL的单细胞悬 液，加入10μL抗体，在4°C下孵育30min，用PBS洗涤1次，1000r/min离心5min，用500μL 的PBS重悬细胞，然后上流式细胞仪检测，进行对比。
[0028] 本发明与现有技术相比所产生的有益效果是：
[0029] 本发明的一种无血清的脐带间充质干细胞培养基克服了血清外源性污染缺陷和 细胞扩增数量与降低成本之间的矛盾问题。
[0030] 本发明的一种无血清的脐带间充质干细胞培养基，不含血清，可避免动物源血清 成份对细胞培养的影响；成份明确，可用于研究脐带间充质干细胞的分化增殖调节机制； 培养基中添加了植物多糖黄芪多糖促进脐带间充质干细胞的增殖，替代特殊抗体因子，降 低了成本。
[0031] 培养于本发明无血清的脐带间充质干细胞培养基中的脐带间充质干细胞保持良 好的贴壁特性，脐带间充质干细胞均呈现出梭形的成纤维状细胞形态。
[0032] 本发明生长培养基中的脐带间充质干细胞在54小时前能够生长至平台期。但对 照生长培养基中的脐带间充质干细胞只能在66小时后才能够生长至平台期。由此可以看 出，本发明的生长培养基能够有效地加速脐带间充质干细胞的生长速度。
[0033] 本发明所述无血清培养基和对照组培养基培养MSC流式细胞表型对比结果显示， 本发明提供的无血清培养基和对照组培养基MSC阳性表达⑶73、⑶90、⑶105,阴性表达 ⑶14、⑶19、⑶34和⑶45,没有统计学差异。
【附图说明】
[0034] 图1A和图1B为不同干细胞培养基培养的脐带间充质干细胞的形态图片：
[0035]图1A为本发明无血清的脐带间充质干细胞培养基培养的脐带间充质干细胞的形 态图片；
[0036] 图1B为普通干细胞培养基培养的脐带间充质干细胞的形态图片。
[0037] 图2不同的生长培养基中生长的脐带间充质干细胞的生长曲线图：
[0038]图2中的1曲线为本发明无血清的脐带间充质干细胞培养基培养的生长曲线图；
[0039]图2中的2曲线为普通干细胞培养基培养的脐带间充质干细胞的生长曲线图；
[0040] 图2中，横坐标表示生长时间（单位为小时），纵坐标表示550nm处测定各孔吸光 光度值（0D值）。
【具体实施方式】
[0041] 下面对本发明的一种无血清的脐带间充质干细胞培养基作以下详细说明。
[0042] 本发明的一种无血清的脐带间充质干细胞培养基，以及利用该培养基使脐带间充 质细胞传代培养及扩增能力的实验方法，其句哟实施的实验是：
[0043](一）无血清培养基中细胞因子的组合实验：
[0044] 所选用的生长因子：重组人成纤维细胞生长因子2(hFGF)、人重组胰岛素（hi)、人 重组表皮生长因子（hEGF)、人重组白血病抑制因子（hLIF)和黄芪多糖（APS)浓缩液，经无 囷过滤除囷，冷减或冻减备用。
[0045] 对于不同的生长因子设计不同的浓度（表1)添加到培养液中并根据生长曲线找 到该生长因子的最佳效应浓度。经过浓度的筛选实验将最佳浓度的不同生长因子进行组合 (表2)，考察各自对干细胞生长情况的影响（表3)，得到最佳生长因子组合培养液。
[0046] 表1各种生长因子的浓度
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[0048] 表2细胞因子及浓度组合表
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[0051] 表3不同组合的培养基体系中细胞生长增殖的对比
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[0055] 表4是日本田口正交试验得出结果。
[0056] 根据表4结果分析：综合培养相同天数后细胞收获量和所需成本考量，各生长因 子最佳效应浓度最终确定为：
[0057] hFGF的最佳浓度为10ng/ml，
[0058] hEGF的最佳浓度为10μg/ml，
[0059]hi的最佳浓度为10μg/ml，
[0060] hLIF的最佳效应浓度为lng/ml，
[0061] APS的最佳效应浓度为0·lmg/ml。
[0062](二）脐带间充质细胞在培养基中传代培养及扩增能力的比较分析
[0063] 1.把经常规法分离所得并液氮保存的脐带间充质干细胞冻存管从液氮中取出来， 立即投入37°C水浴锅中，轻微摇动（2min内溶解），同时预热上述培养基。
[0064] 2.把经37°C解冻后的脐带间充质干细胞吸到装有9mL培养基的15mL的离心管 中，同时用培养液洗2次冻存管，一起加到离心管中吹匀，避免产生泡沫。然后250G转速离 心5分钟。
[0065] 3.弃上清液，分别加2mL预热的上述培养基，轻轻吹勾，保证细胞完全悬浮起来； 将重悬的细胞接种到T25的培养瓶中，加入适量的培养液，再把细胞摇均匀，保证所有的细 胞能够均匀的分布。
[0066] 4.标好细胞种类和日期、培养基种类等，放入3