羟乙基淀粉修饰的促红细胞生成素模拟肽及其制备和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医学领域，涉及一种羟乙基淀粉修饰的促红细胞生成素模拟肽。 具体地说，本发明涉及一种能够和促红细胞生成素受体结合并激活促红细胞生成素受体或 者能起促红细胞生成素激动作用的羟乙基淀粉修饰的促红细胞生成素模拟肽及其制备方 法，本发明还涉及所述模拟肽在制备治疗以缺乏红细胞生成素或红细胞群缺少或缺陷为特 征的疾病的药物中的用途。
【背景技术】
[0002] 促红细胞生成素（erythropoietin，ΕΡ0)是一种糖蛋白激素。人类促红细胞生成 素基因位于7号染色体长22区。1985年其cDNA被成功克隆，并利用基因重组技术开始大 批量生产重组人促红细胞生成素（recombinanthumanerythropoietin,rHuEPO)，广泛用 于临床。应用重组DNA技术已经生物合成出促红细胞生成素（Egrie，JC，Strickland,TW， Lane，J等（986)免疫生物学（Immunobiol)72:213-224)，其是插入到中国仓鼠的卵巢组织 细胞（CH0细胞）中并且表达的克隆的人促红细胞生成素基因的产物。天然存在的人促红细 胞生成素首先翻译成含有166个氨基酸并且166位是精氨酸的多肽链。在翻译后修饰中， 用羟肽酶裂解掉166位精氨酸。没有糖基的人ΕΡ0的多肽链的分子量是18236Da，在完整 的促红细胞生成素分子中，糖基占整个分子量的大约40% (J.Biol.Chem. 262:12059)。
[0003] 促红细胞生成素是最早应用于临床的细胞因子，是迄今所知作用最单一、且安全 可靠的升血红蛋白制剂。对于肾贫血、再生障碍性贫血、多发性骨髓瘤及阵发性夜间血尿等 均有一定疗效；此外，应用促红细胞生成素还可减少手术中的输血量，并能在一定程度上纠 正由恶性肿瘤、化疗及类风湿性关节炎引起的贫血。由于促红细胞生成素主要由肾小管内 皮细胞产生，肾性疾患引起的贫血是促红细胞生成素的首选适应证；促红细胞生成素纠正 肾性贫血的疗效几乎100%，但并不能改善肾功能。促红细胞生成素的治疗安全、有效，适合 长期治疗，也能避免血源紧张。在2006年的全球生物技术药市场上，促红细胞生成素类的 重组药物占了 119亿美元，有巨大的市场容量。
[0004] 当人体处于健康状态时，组织可以从已经存在的红血球中吸收足够多的氧，此时 体内的促红细胞生成素浓度很低，这种正常的较低的促红细胞生成素浓度完全可以刺激促 进由于年龄的问题而正常损失的红细胞。当循环系统中的依靠红细胞进行氧输送的水平被 降低进而出现缺氧情况时，促红细胞生成素在体内的数量将会增加。作为对组织处于缺氧 压力的应答，促红细胞生成素水平的提高可以刺激红组细胞的分化达到提高红细胞生成的 能力。当体内的红细胞的数量大于正常组织的需求时，循环系统中促红细胞生成素的水平 被降低。正是由于促红细胞生成素对于红细胞的生成有着至关重要的作用，因此这类激素 对于治疗和诊断以红细胞生成低下和缺陷为特征的血液病方面有着很广泛的前景。
[0005] 促红细胞生成素的部分生物学效应可以通过和细胞膜表面的受体内在作 用来调节。起先，使用从小鼠的脾脏里分离出的未成熟的红细胞来研究细胞表面结 合的促红细胞生成素蛋白时发现，这种蛋白是由两种多聚肽组成，其分子量大约为 85000-100000KD(Sawyer，etal.(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA84:3690-3694)由比较 详细的叙述。促红细胞生成素的结合位点的数目也被计算出来了，大约每个细胞膜含有 800-1000个位点。在这些结合位点中大约有300个结合位点的Kd水平为90pM，而剩下的 结合位点的结合力比较弱，大约有570pM。有研究表明从感染了friend病毒贫血株的小鼠 的脾脏红细胞对ΕΡ0的响应情况发现，大约有400个结合位点，其中Kd水平高的为ΙΟΟρΜ， Kd水平低的为800pM。
[0006] 随后的工作就是两种促红细胞生成素受体被单个基因翻录，这个基因已经被克 隆。例如，小鼠和人的促红细胞生成素受体的DNA序列以及编码肽的序列在W090/08822中 已经有叙述。目前的模型表明促红细胞生成素结合到促红细胞生成素受体导致了两个促红 细胞生成素受体的活化和二聚，这种二聚进一步导致了信号传导的开始。
[0007] 促红细胞生成素克隆基因的应用更有助于帮助寻找这些重要受体的激动剂和拮 抗剂。某种程度上能够作用促红细胞生成素受体的肽已经被确定和叙述。特别是确定了一 组含有主要肽段的肽，这些肽可以和促红细胞生成素受体结合并能刺激促红细胞生成素细 胞的分化增殖。但是能够刺激红细胞增殖分化的肽的EC50却很低，在20nM和250nM之间， 因此这些肽在临床应用上受到了较大的限制。
【发明内容】
[0008] 为了克服现有技术的不足，本发明提供了一种生物活性更好、生物利用度更高的 羟乙基淀粉修饰的促红细胞生成素模拟肽及其可药用盐和它们的制备方法。
[0009] -方面，本发明的目的是提供一种具有长效促红细胞生成功能的羟乙基淀粉修饰 的促红细胞生成素模拟肽及其可药用盐。
[0010] 再一方面，本发明还提供了本发明羟乙基淀粉修饰的促红细胞生成素模拟肽的制 备方法以及其在用于制备治疗以缺乏红细胞生成素或红细胞群缺少或缺陷为特征的疾病 的药物中的用途。
[0011] 本发明的又一方面还提供一种药物组合物，该药物组合物包含本发明的羟乙基淀 粉修饰的促红细胞生成素模拟肽。
[0012] 优选地，本发明药物组合物为注射剂；更优选地，本发明药物组合物为冻干粉针或 溶液注射剂。
[0013] 在一个优选实施方案中，本发明药物组合物还包含药学上可接受的辅料成分。
[0014] 本发明提供了一种具有体内生物活性的羟乙基淀粉修饰的促红细胞生成素模拟 肽及其可药用盐。
[0015] 所述羟乙基淀粉修饰的促红细胞生成素模拟肽是由通式式I表示；
[0016]
[0017] 其中，两个半胱氨酸形成二硫键，X表示琥珀酸羟乙基淀粉，C末端赖氨酸（K)通过 侧链游离氨基与X的羧基缩合。
[0018] 本发明还提供了所述羟乙基淀粉修饰的促红细胞生成素模拟肽或其可药用盐的 制备方法，所述方法包括以下步骤：
[0019] 1)根据式1选择氨基酸；
[0020] 2)采用1，1-双（对氯苯基）-2, 2-二氯乙烯保护赖氨酸，使用Fmoc固相多肽合成 法合成单体肽；
[0021] 3)采用1，1-双（对氯苯基）-2, 2-二氯乙烯脱保护剂脱去赖氨酸的1，1-双（对 氯苯基）_2, 2-二氯乙烯基团；
[0022] 4)利用赖氨酸侧链上游离的氨基与琥珀酸羟乙基淀粉偶联。
[0023] 其中，本发明所述的Fmoc固相多肽合成方法是指以聚合物树脂作为固相反应基 质，将氨基端Fmoc保护的氨基酸在偶联试剂的存在下依次缩合，从而合成多肽的合成方 法。
[0024] 优选地，所述制备方法还包括：5)将步骤4)制得的模拟肽纯化，经脱盐及冷冻干 燥得到冻干粉；优选地，所述纯化使用HPLC C18半制备柱进行，流动相为乙腈。
[0025] 本发明提供的羟乙基淀粉修饰的促红细胞生成素模拟肽通过公知技术可使用酸 性或碱性化合物与之反应成盐，通常采用的形成酸加成盐的酸为：盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫 酸、磷酸、对甲苯磺酸、甲磺酸、草酸、对溴苯基磺酸、碳酸、琥?白酸、梓檬酸、苯甲酸、乙酸。
[0026] 优选地，所述羟乙基淀粉修饰的促红细胞生成素模拟肽的可药用盐选自硫酸盐、 焦硫酸盐、三氟乙酸盐、亚硫酸盐、亚硫酸氢盐、磷酸盐、磷酸氢盐、磷酸二氢盐、偏磷酸盐、 焦磷酸盐、盐酸盐、溴化物、碘化物、乙酸盐、丙酸盐、