将U87MG、MDA-MB-231细胞分别在共聚焦皿中培养12小时后，加入RhB-HS-Ι共孵 育2小时后，吸弃培养液，并用PBS缓冲液洗涤2-3次后在共聚焦显微镜下观察其荧光强度 并与单独染料RhB进行比较。
[0036](三）活体肿瘤靶向实验：
[0037] 本发明应用于体内动物实验的近红外荧光染料为有机染料ICG-Der-02,与HS-1 肽通过酰胺键连接，简称ICG-Der-02-HS-l，连接方法具体为取2mgICG-Der-02(详见 参考文南犬：JieCao，ShunanWan,JunmeiTian,SiwenLi,DaweiDeng.Fastclearing RGD-basednear-infraredfluorescentprobesforinvivotumordiagnosis， ContrastMediaMol.Imaging2012,7390-402)溶于lmlPBS(pH为 7. 4)中，加入 1-乙 基-(3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺盐酸盐N-羟基琥珀酰亚胺（EDC/NHS)(摩尔比 ICG-Der-02 :EDC:NHS=1 : 1.5 : 1.5)，避光反应 4h，活化。称取lmmolHS-1 肽溶 入含有荧光染料ICG-Der-02的lmlPBS缓冲液（Ph7. 4)中，室温避光搅拌过夜。反应结 束后，反应液浓缩后通过葡聚糖凝胶G-25柱，PBS缓冲液（Ph7. 4)作洗脱液，得到纯化的 ICG-Der-02-HS-l，-20°C储存备用。
[0038](四）体外肿瘤细胞摄取实验：
[0039]U87MG、MDA-MB-231荷瘤裸鼠均被尾静脉注射ICG-Der-02标记的HS-1肽。在注 射后的0-24小时，通过近红外成像系统在不同的时间点分别对裸鼠进行成像检测。
[0040] 实验结果：
[0041] 人脑胶质瘤U87MG细胞和人乳腺癌MDA-MB-231细胞为整合素受体高表达细胞。图 1显示了由RhB-HS-Ι探针及单独RhB孵育的U87MG和MDA-MB-231细胞的共聚焦显微镜成 像图。细胞成像结果表明，RhB-HS-Ι探针进入细胞后主要聚集在细胞质中，而不进入细胞 核。与RhB-HS-Ι共同孵育的整合素受体高表达的U87MG细胞和MDA-MB-231细胞均具有较 高的荧光强度，而对于单独孵育RhB的细胞荧光强度较低。说明HS-1肽对整合素高表达的 细胞有很强的靶向性。
[0042]U87MG细胞和MDA-MB-231细胞为整合素受体高表达细胞，如果一定的时间内探针 在裸鼠体内肿瘤部位聚集且能持续一定的时间就说明这种探针能够靶向到肿瘤细胞上。如 图2所示，分别注射相同量的ICG-Der-02-HS-l这种探针到U87MG和MDA-MB-231荷瘤裸鼠 后，首先2h荧光信号分布到全身，然后逐渐转移到肾-膀胱代谢途径，肿瘤部位在探针注射 4h后，开始有较弱的荧光信号，随着探针在体内的代谢，探针在肿瘤部位聚集越来越多，其 荧光强度在注射后的12h达到峰值，肿瘤边缘的轮廓较清晰，24h后肿瘤部分荧光信号基本 消失。这一结果说明探针ICG-Der-02-HS-l对整合素受体高表达U87MG和MDA-MB-231肿 瘤有较好的靶向性，且这种探针可快速靶向到U87MG和MDA-MB-231肿瘤部位，这一结果也 从动物水平上说明HS-1肽能够靶向到整合素高表达的肿瘤细胞处，从而起到靶向治疗的 目的。
[0043](五）HS-1对荷鼠源肝癌HAC小鼠肿瘤的抑瘤效应：
[0044] 将培养的小鼠肝癌细胞HAC用0. 05 %的胰酶消化，lOOOrpm离心5min，重悬与 PBS，在小鼠体侧皮下接种5X105细胞0.lml。当肿瘤平均体积达到200mm3-300mm3,随机 将小鼠分组，每组10只，其中一组接受HS-1治疗，一组用内皮抑素治疗，以上两组剂量均 为5mg/kg/d，对照组注射生理盐水。治疗采用在接种肿瘤对侧皮下注射方法。每天用游 标卡尺测量肿瘤大小，计算肿瘤体积。治疗效果用给定时间内的肿瘤抑制率表示：（ι-τ/ C)X100%，Τ=治疗组肿瘤体积，C=对照组肿瘤体积。
[0045] 如表1所示，在治疗第十天时，HS-1的肿瘤抑制率为86.8%，而内皮抑素的肿瘤抑 制率为34% (Ρ<0. 05).以上实验说明本发明所设计的高效靶向肿瘤血管生成抑制剂能够 显著抑制小鼠体内的肿瘤生长。
[0046] 表1.HS-1小鼠体内抑制小鼠肝癌细胞HAC效果
[0047]
[0048](六）HS-1对荷人源乳腺癌MD-MBA-231裸鼠肿瘤的抑瘤效应
[0049] 取生长旺盛期的瘤组织剪切成1. 5mm3左右，在无菌条件下，接种于裸鼠右侧皮下。 当肿瘤平均体积达到100_ 3-200_3,随机将小鼠分组，每组10只，其中一组接受HS-1治疗， 一组用内皮抑素治疗，以上两组剂量均为5mg/kg/d，对照组注射生理盐水。治疗采用在接种 肿瘤对侧皮下注射方法。每天用游标卡尺测量肿瘤大小，计算肿瘤体积。治疗效果用给定 时间内的肿瘤抑制率表示：（1-T/C)X100%，T=治疗组肿瘤体积，C=对照组肿瘤体积。
[0050] 如表2所示，在治疗第十天时，HS-1的肿瘤抑制率为87. 3%，而内皮抑素的肿瘤抑 制率为36% (P<0. 05).以上实验说明本发明所设计的高效靶向肿瘤血管生成抑制剂能够 显著抑制裸鼠体内的肿瘤生长。
[0051] 表2.HS-1裸鼠体内抑制人源乳腺癌细胞MB-MDA-231效果
[0052]
[0053] 以上对本发明的一个实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施 例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进 等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。
【主权项】
1. 一种血管生成抑制剂多肽HS-1，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO. 1所示。2. 如权利要求1所述的血管生成抑制剂多肽HS-I在诊断、预防和治疗肿瘤中的应用。3. 如权利要求1所述的血管生成抑制剂多肽HS-I的合成方法，包括以下步骤： 1) 偶联：将荷甲氧羰酰基-天冬氨酸-rink氨基树脂溶胀于DMF中，接着用piperdine/ DMF溶液脱去Fmoc保护基，用DMF洗涤脱帽子后的树脂，加入原料Fmoc-Arg (tBU) -OH，缩合 剂用HBTU ;kaiser法检偶联反应是否完成；重复上述操作，依次偶联Fmoc-Gly(OtBU)-OH, ... FmocGly-OH ；Fmoc-Pro (Boc) -OH ；Fmoc-Val (Boc) -OH.........·· Fmoc-Ser (Pbf) -〇H，完成 所有直链肽合成后，用甲醇洗涤所得到的peptidylresin，真空干燥箱里充分干燥； 2) 树脂与肽的分离裂解： ① 裂解液的配制：裂解液的配比如下： 名称 比例 三氟乙酸： 90% (V/V) 1，2 乙二硫醇： 2.5% (V/V) 苯甲硫醚： 2. 5%(V/V) 去离子水： 5% (V/V) ② 裂解液配好后，混合均匀，放在冰箱里冷藏，然后将裂解液加入树脂中磁力搅拌，然 后，将裂解液与树脂分离，弃去树脂，保留滤液，将滤液缓慢滴加到冰无水乙醚中，滴加完毕 后，自然沉降，然后在高速离心机里离心，弃去上清液，保留沉淀，将所得沉淀在干燥箱中干 燥，得到干粉粗品； 3) 纯化： 取上述干粉粗品，用〇. 1 % TFA/H20溶解。经过滤后，上样到C18制备柱，用HPLC进行 梯度洗脱，收集目标肽的洗脱液体。
【专利摘要】本发明提供一种血管生成抑制剂多肽HS-1，所述多肽由19个氨基酸组成，其序列为Ser-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Asp，所述多肽HS-1具有肿瘤特异选择性。本发明的另一方面还包括所述多肽HS-1在诊断、预防和治疗肿瘤中的应用。本发明的有益效果是所述多肽HS-1具有靶向性的同时具有较强的抗肿瘤活性。
【IPC分类】C07K1/16, C07K1/06, A61K38/10, A61P35/00, C07K1/36, C07K1/30, G01N33/68, C07K7/08
【公开号】CN105418735
【申请号】CN201510901937
【发明人】李斯文, 赵磊
【申请人】李斯文
【公开日】2016年3月23日
【申请日】2015年12月5日