一种定点突变改造的人二肽基肽酶iii的利记博彩app
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种二肽基肽酶III，特别涉及一种定点突变改造的人来源的二肽基 肽酶III。
【背景技术】
[0002] 二肽酶III (DPPs III，EC 3.4. 14. 4)，如来自酵母的二肽酶III、来自人类的二肽 酶ΙΠ 、来自人的二肽酶III、来自兔的二肽酶III等，是一组分子内含有特殊的HEXXGH锌 指结构的金属蛋白酶，具有水解多肽链的氨基末端切掉二肽的肽酶。DPPIII在生理功能上 与脑啡肽和血管紧张素 II、血管紧张素 III、促黑色素等重要的生理活性肽的新陈代谢有 关。DPPsS在于各种哺乳动物的组织中，根据亚细胞的定位、特异性地无核抑制剂的敏感 性，二肽基肽酶分成不同的类型DPP I~DPP IV13DPP III可以选择性地从多肽链或蛋白质 的N-末端水解掉二肽残基，如：Arg-Arg-，Ala-Arg-，或者Tyr-Gry。人DPP III由737个 氨基酸组成，锌离子是其催化金属离子。其氨基酸序列与黄曲霉毒素单加氧酶（Aflatoxin monooxygenas，AFM0)有54. 95%的同源性，但不具有对6-甲氧基双咲喃香豆素氧化分解的 功能。
[0003] 黄曲霉毒素主要是由黄曲霉和寄生曲霉等真菌产生的剧毒性次生代谢产物，已经 确定的黄曲霉毒素分子的结构主要有八种，其中毒性最强的黄曲霉毒素 Bl (也称6-甲氧 基双呋喃香豆素）被认为是潜在的对人类危害极为突出的一类强致癌诱变剂，一次大量摄 入会引起人及动物的急性中毒、甚至死亡；小剂量长期摄入会致畸、致突变和致癌，即使几 十PPb的含量仍有极大的毒性；I族黄曲霉毒素含有呋喃双键结构。目前，已经发现的对 6-甲氧基双呋喃香豆素具有分解作用的生物酶极少。黄曲霉毒素单加氧酶（AFMO)是一个 对6-甲氧基双呋喃香豆素有氧化分解作用的酶。经研究发现黄曲霉毒素单加氧酶氧化分 解6-甲氧基双呋喃香豆素的过程为：从底物分子中获得电子传递给氧，使水还原成过氧化 氢，将底物氧化并进一步使分子中的呋喃双键开环。在这个过程中，由分子内的变价离子的 价态变化来实现电子的传递，首先，结合在AFMO上的二价金属离子夺得底物的一个电子， 自身变成一价离子，然后不稳定的一价离子将夺得的这个电子传递给氧，自身又转变成稳 定的二价离子，氧气分子获得一个电子在水分子的参与下生成过氧化氢，同时底物转变为 它的环氧化物。然后，该环氧化物伴随着过氧化氢的作用发生氧化水解反应，最终使底物分 子中的呋喃双键断开。黄曲霉毒素单加氧酶是目前已报道的用于黄曲霉毒素解毒的生物 酶。因此，发现和制造新的对6-甲氧基双呋喃香豆素具有氧化分解作用的酶，对发展黄曲 霉毒素消减技术具有十分重要的现实意义。
【发明内容】
[0004] 本发明的首要目的是提供一种定点突变的人二肽基肽酶III，该人二肽基肽酶 III突变体对6-甲氧基双呋喃香豆素具有氧化分解功能。
[0005] 本发明所述的一种定点突变改造的人二肽基肽酶III是由氨基酸序列为SEQ ID NO. 1的人二肽基肽酶III(NCBI数据库登录号为AJ271216. 1)中制造多个氨基酸取代而产 生的、对6-甲氧基双呋喃香豆素有氧化分解作用的人二肽基肽酶III突变体，所述的氨基 酸取代包括第560、562和564位的取代。
[0006] 根据本发明所述的定点突变改造的人二肽基肽酶III的进一步特征，所述第560 位的氨基酸取代是用丙氨酸（Alanine, Ala, A)取代谷氨酸（Glutamic acid, Glu, E);第562 位的氨基酸取代是用赖氨酸（Lysine，Lys, K)取代苯丙氨酸（Phenylalanine, Phe, F);第 564位的氨基酸取代是用组氨酸（Histidine, His, H)取代色氨酸（Tryptophan, Trp, W);所 述的定点突变改造的人二肽基肽酶III突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO. 2。
[0007] 经实验验证，本发明所述的定点突变改造的人二肽基肽酶III (以下缩写为 "humDPP"）具有对于6-甲氧基双呋喃香豆素的氧化分解功能。该突变体酶在pH 6.0、反应 温度25°C处理6-甲氧基双呋喃香豆素（IOOppb) 50分钟后，其对6-甲氧基双呋喃香豆素的 氧化分解效率达到89. 6%。该突变体酶的其它酶学性质与野生酶相似。
[0008] 进一步地，本发明提供了一种DNA分子，其编码本发明所述的定点突变改造的人 二肽基肽酶III。
[0009] 优选地，本发明所述的DNA分子的核苷酸序列为SEQ ID NO. 3。
[0010] 本发明的另一个目的是提供一种载体，其含有本发明所述的DNA分子。
[0011] 本发明的又一个目的是提供一种宿主细胞，其含有本发明所述的DNA分子，或者 含有本发明所述的载体。
[0012] 上述载体和宿主细胞都可以通过本领域公知的技术手段进行制备。
[0013] 本发明还提供了本发明所述的定点突变改造的人二肽基肽酶III的生产方法，包 括：在适于二肽基肽酶III表达的条件下培养本发明所述的宿主细胞，并从培养基中分离 所述的人二肽基肽酶III。
[0014] 当本发明所述的DNA分子以合适的取向和正确的阅读框插入到所述的载体或者 转入所述的宿主细胞中，所述的DNA分子可以在任何真核或者原核表达系统中表达。许多 宿主-载体系统都可以用来表达蛋白质编码序列。宿主-载体系统包括但不限于：用噬 菌体、质粒或粘粒转化的细菌；含有人载体的微生物，如人；用病毒感染的哺乳动物细胞系 统；用病毒感染的昆虫细胞系统；用细菌感染的植物细胞系统。本发明优选的载体包括病 毒载体、质粒、粘粒或者寡核苷酸。
[0015] 本发明优选的宿主为真核系统如毕赤人；本发明优选的蛋白质表达方法为毕赤人 甲醇诱导分泌表达。
[0016] 本发明人成功地获得了一种定点突变改造的人二肽基肽酶III，通过活性鉴定实 验，证明该二肽基肽酶III突变体具有野生型二肽基肽酶III所不具备的氧化分解6-甲氧 基双呋喃香豆素的生物活性，且该生物活性达到了应用于饲料及其添加剂加工、食品及其 添加剂加工以及药物开发的程度。
[0017] 本发明的另一目的是提供将所述的定点突变改造的人二肽基肽酶III在制备饲 料及其添加剂或食品及其添加剂中消除6-甲氧基双呋喃香豆素的产品的应用。结合目前 的饲料和食品的加工工艺，可将本发明所述的定点突变改造的人二肽基肽酶III作为脱毒 剂添加到饲料中进行饲料脱毒，或者制成固定化酶用于如花生油等食品的脱毒，或制成能 够表达该酶的益生菌制剂或益生菌微囊等用于食品、粮油、饲料等的脱毒。
[0018] 本发明的另一目的是提供将所述的定点突变改造的人二肽基肽酶III在制备预 防由6-甲氧基双呋喃香豆素诱发的疾病的药物的应用。结合目前的常规药物制备工艺，可 用本发明所述的定点突变改造的人二肽基肽酶ΠΙ制得到用于预防由6-甲氧基双呋喃香 豆素诱发的疾病（例如肿瘤）的药物。
【附图说明】
[0019] 图1为重组质粒humDPP表达质粒的鉴定图。
[0020] 图2为重组humDPP和重组WthDPP的纯化结果。
【具体实施方式】
[0021] 本文中所采用的术语，除非另有说明，均为本领域技术人员所通常理解的含义。以 下提供在本发明中使用的一些特殊术语的定义。
[0022] "WthDPP"表示野生型人二肽基肽酶III，其基因以斜体WthDPP表示。
[0023] "humDPP"表示突变体人二肽基肽酶III，其基因以斜体humDPP表示。
[0024] 实施例1 :wthDPP和humDPP的合成
[0025] 本发明以Homo sapiens的二肽基肽酶基因（NCBI数据库AJ271216. 1)序列作为 参考，在 5' 端加入 5' -GTCGAATTC-3' 在 3' 端加入 3' -CCTAGGGAC-5'，(GAATTC)为限制酶 切位点EcoRI，(GGATCC)为限制酶切位点BamHI。采用人工全合成的方法合成wthDPP基因。
[0026] 本发明以Homo sapiens的二肽基肽酶基因（AJ271216. 1)序列作为参考，将第560 位的氨基酸用丙氨酸（Alanine，ALa，A)取代，第562位的氨基酸用赖氨酸（Lysine，Lys，K) 取代，第564位的氨基酸用组氨酸（Histidine, His, Η)取代，在5'端加入5'-GTCGAATTC-3' 在3'端加入3' -CCTAGGGAC-5'，（GAATTC)为限制酶切位点EcoRI，(GGATCC)为限制酶切位 点BamHI。采用人工全合成的方法合成humDPP目的基因。
[0027] 在定点突变改造后，第560位的丙氨酸（Alanine，ALa，A)、第562位的赖氨 酸（Lysine，Lys, K)、第564位的组氨酸（Histidine, His, H)与第566位的谷氨酰 胺（Glutamine, Gin, Q)、第 568 位的组氨酸（Histidine, His, H)、第 569 位的甲硫氨 酸（Methionine, Met, M)、第 570 位的谷氨酰胺（Glutamine, Gin, Q)、第 571 位的丙氨酸 (Alanine，ALa, A)以及第 572 位的精氨酸（Arginine，Arg, R)形成一个 AXKXHXQXHMQAR(A 为丙氨酸，K为赖氨酸，H为组氨酸，X为任意氨基酸）序列。
[0028] 基因合成由商业性公司（例如上海捷瑞生物有限公司）完成。
[0029] 实施例2 :重组质粒WthDPP和humDPP表达质粒的构建
[0030] 基因克隆按常规方法（Sambrook, et al. 2001，Molecular Cloning A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Labroratory Press. USA)进行，将实施例 1 所得的 wthDPP和humDPP分别克隆到pHIL-Sl构建成表达质粒pHIL-Sl-wthDPP和表达质粒 pHIL-Sl-humDPP，克隆后的目的基因经酶切、测序鉴定。
[0031] 具体做法：
[0032] 含humDPP的重组质粒pHIL-Sl的构建过程为：EcoRI+BamHI双酶切质粒pHIL-Sl 和目的片断humDPP，酶切产物进行0. 8%琼脂糖凝胶电泳，并切胶回收。利用T4DNA连接酶 进行质粒PHIL-Sl和humDPP的连接。CaCl2法制备E. coli DH5 α感受态细胞，转化DH5 α 感受态细胞，筛选转化子，碱提质粒。用EcoRI+BamHI、Hind III、SacI酶切鉴定重组质粒 pHIL-Sl-humDPP。挑取重组质粒 PEG 纯化法（Sambrook，et al. 2001，Molecular Cloning A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Labroratory Press. USA)提取质粒 DNA〇 以 T7和SP6为测序引物，采用DNA自动序列仪，正反向进行测定。酶切结果如图I示，重组载 体？!111^-31-1111111〇??的酶切鉴定，8 &111!114(3〇1?1双酶切（样品1)切下一条带位于210(^?左 右，HindIII单酶切（样品2)，SacI单酶切（样品3)。
[0033] 含WthDPP的重组质粒pHIL-Sl的构建过程为：将含humDPP的重组质粒pHIL-Sl 的构建过程中的目的片断humDPP替换为wthDPP，其他操作过程与含humDPP的重组质粒 pHIL-Sl的构建过程相同。
[0034] 实施例3 :重组humDPP和重组WthDPP的表达
[0035] 重组humDPP的表达：用SacI酶切重组质粒pHIL-Sl-humDPP和质粒pHIL-Sl，酶切 产物进行〇. 8%琼脂糖凝胶电泳，切胶回收酶切后的线性重组质粒pH