烟草光受体基因NtPHYB1、其编码蛋白及在烟叶多酚调控中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及基因工程领域，特别是涉及一个烟草光受体基因、其编码蛋白及其在烟叶多酚代谢调控中的应用。
[0002]
【背景技术】
多酚类化合物对烟草品质、色泽和烟气生理强度等方面有着重要影响，因此是衡量烟草质量的一个重要因素。曾有人提出以酚类化合物含量与蛋白质氮含量的比值作为判断烟草芳香吃味的依据。
[0003]已知有许多因素可影响多酚类物质在烟草中的含量，包括烟草品种和类型、着生部位、成熟度、光照、温度、营养及调制方法等。遗传基因、栽培管理以及调制技术的综合作用决定了各种类型烟草中多酚类物质的组分和含量。多酚类化合物的数量和组分的差异都是可以遗传的。在烟草中发现的多酚类及其衍生物种类繁多，因烟草类型和品种的不同，多酚类物质含量变化范围在0.4-6.0%。据报道，多酚含量高的品种其后代的多酚含量也高，多酚含量低的品种其后代多酚含量也低。这说明烟草中的多酚含量是受基因控制的，品种间多酚水平的差异能够传递给后代。因而可以通过育种方法来选育多酚含量适宜的烟草品种，但是传统的育种方法费时费力，伴随着分子生物学技术的发展，利用基因工程手段挖掘、验证和利用调控多酚代谢的重要功能基因，将为烟叶多酚类物质的分子调控提供重要的理论和技术支撑，从而提高烟草品质。
【发明内容】
[0004]
本发明的目的为了克服上述缺点而提供的一种调节烟叶多酚类物质含量，从而提高烟草品质的烟草NtPHYBl蛋白。
[0005]本发明的另一目的是提供编码该烟草NtPHYBl蛋白的心基因。
[0006]本发明的再一个目的是提供该基因及其编码蛋白NtPHYBl在调节烟叶多酚含量中的应用。
[0007]本发明的烟草NtPHYBl蛋白为:由SEQ ID N0.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质或在SEQ ID N0.1所示的氨基酸序列中经取代、缺失和/或添加一个或几个氨基酸且具有同等活性的蛋白质。
[0008]本发明的烟草NtPHYB 1 蛋白的 NtPHYBli^M% Nico tiana tabacum Phytochrome方)基因，具有SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列。
上述的烟草基因是从烟草K326 ( Nico tiana tabacum cv.K326)品种中通过RT-PCR克隆到的一个基因。
[0009]上述的烟草NtmYBl基因，其过表达和RNA干扰植物表达载体分别为pEarleyGatelOO 和 pB7GWIWG2(I)。
[0010]本发明与现有技术相比，具有明显的有益效果，从以上技术方案可知:本发明的基因的蛋白序列与拟南芥AtPHYB蛋白的氨基酸序列之间的相似性为75%，因此推测与拟南芥因的功能类似。
[0011]将NtPHYBl基因构建到过表达载体pEarleyGatelOO及RNA干扰载体PB7GWIWG2 (I)上，并在大肠杆菌DH5a中扩繁。通过农杆菌介导的叶盘转化方法，分别将pEarleyGatelOO及pB7GWIWG2 (I)携带的价基因转入普通烟草中，获得烟草转化植株。结果表明，过表达具有上调苯丙氨酸解氨酶(NtPAL)的转录水平，从而提高烟叶多酚类物质含量的功能；或通过RNA干扰可降低烟叶中多酚类物质含量，从而实现烟叶多酚类物质含量的改良。
[0012]因此，基因及其编码蛋白可以调节烟叶多酚含量，快速、高效地实现烟草品质改良。
[0013]本发明还可提供含有亥苷酸序列或其片段的克隆载体或各类表达载体、含有所述载体的宿主细胞、含有所述核苷酸序列或其特异片段的转化植物细胞和转基因植物。
[0014]
【附图说明】
图1为烟草光受体基因yVi/^/价编码蛋白的氨基酸序列与拟南芥因编码蛋白的氨基酸序列的比较。
[0015]图2为克隆中间载体pGWCm的结构示意图。
[0016]图3为植物过表达载体pEarleyGatelOO的结构示意图。
[0017]图4为植物RNA干扰载体pB7GWIWG2⑴的结构示意图。
[0018]图5为烟草光受体基因NtHlYBl概基因植物细胞中的定位。
[0019]图6为烟草光受体基因对烟叶多酚类物质含量的影响。
[0020]图7为转基因烟叶中多酚类代谢关键酶的表达水平分析。
[0021]
【具体实施方式】
实施例1
(1)烟草光受体基因的克隆
分别利用SEQ ID N0.3所示的价克隆正向引物5’ - ATGGCTTCTGGAAGTAGAACAAAG-3’ 和 SEQ ID N0.4 所示的价克隆反向引物 5’- CTAGCCAAGACTCTTTGAACCTCTG-3’通过RT-PCR的方法从烟草K326 (Nico tiana tabacum cv.K326)中扩增基因。
[0022]PCR 反应程序为:95°C 5min 预变性，95°C 30S，50°C 35S，72°C 3min30S，30 个循环，72°C lOmin 延伸。
[0023]克隆载体的获得:将扩增获得的PCR产物直接按照TA克隆方法克隆到如图2所示的克隆中间载体pGWCm上。先将pGWCm载体用Ahd I内切酶水解后用凝胶回收试剂盒回收酶切产物以获得T载体。然后PCR产物和T载体于16°C进行12小时连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5 α，并在其中扩增，筛选阳性克隆，并测序。
[0024]获得的NtPHYBl基因，其基因序列如SEQ ID N0.2所示；由其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0025]( 2 )烟草光受体基因的植物表达载体及遗传转化
将烟草光受体基因NtPHYBl的克隆载体分别与如图3所示的植物过表达载体pEarleyGatelOO (购自Invitrogen)及如图4所示的植物RNA干扰载体pB7GWIWG2 (I)等比例混合后通过LR反应(两种质粒各50ng，LR酶1ml，补ddH20至终体积5ml，混勾后25°C反应6小时以上)，将NtPHYBl取H pEarleyGatelOO及pB7GWIWG2 (I)上，分别用于在植物中过表达和RNA干扰烟草光受体基因人研究其功能。烟草的遗传转化方法采用农杆菌介导的叶盘转化法进行，参见《分子克隆实验指南》，2005年。植物中的筛选标记为Bar，从而获得烟草光受体基因的转化植株。
[0026]实施例2
(1)烟草光受体基因编码蛋白的氨基酸序列分析
烟草光受体基因的蛋白序列与拟南芥PHYB蛋白之间的相似性为75%，且在保守功能域高度相似，如图1所示。因此推测烟草基因与拟南芥因的功能类似。
[0027](2)烟草光受体基因码蛋白在转基因植物中的定位
将烟草光受体基因与677?勺融合基因，转化至拟南芥原生质体中。具体方法如下:
1)原生质体提取:
将生长四周左右的拟南芥叶片切成细条，放入甘露醇溶液中；配制酶解液:将上述溶液55°C加热lOmin，室温放置后，加入CaCl2 10mM