新的噬菌体粘附蛋白的利记博彩app
【专利说明】
[0001] 本申请是基于申请日为2009年7月3日，优先权日为2008年7月4日，申请号为 200980125992. 8,发明名称为："新的噬菌体粘附蛋白"的专利申请的分案申请。
技术领域
[0002] 本发明涉及一种结合革兰氏阴性细菌0-抗原的噬菌体粘附蛋白，其缺少结合噬 菌体和水解脂多糖的能力。本发明还涉及一种核酸分子其包括编码本发明蛋白质的序列。 此外，本发明涉及产生本发明的噬菌体粘附蛋白的方法。本发明还涉及所述蛋白质的用途 以及检测、纯化和富集细菌的方法。
[0003] 发曰月背景
[0004] 噬菌体是高度特异的病毒，其仅侵染细菌。侵染时，噬菌体利用粘着结构来与它们 的细菌宿主结合。噬菌体的特异性由其自身的一系列蛋白质来定义，所述一系列的蛋白质 对于与目标细胞的结合是重要的。噬菌体-细菌体系在自然界中已经进化了相当长的时 间，因此噬菌体以高特异性的方式识别它们的宿主细菌，并且具有高水平的结合亲和性。
[0005] 噬菌体特异地结合到细菌上是由于噬菌体粘附蛋白所引起的。噬菌体粘附蛋白特 异地结合到位于细菌表面的不同的一群受体上。这些细菌表面受体可以为脂多糖成分，特 别是革兰氏阴性细菌中的〇-抗原或LPS核以及革兰氏阴性细菌表面的是荚膜多糖的K-抗 原，革兰氏阳性细菌中的肽聚糖或磷壁酸或脂磷壁酸质成分，细菌的膜结合型蛋白，特殊细 菌的突起物例如鞭毛、菌毛或伞部，或胞外成分例如被膜或粘液层，糖类，多糖基质，表面蛋 白质层或细胞壁结合型蛋白。一些噬菌体粘附蛋白有酶活性，例如〇-抗原或K-抗原结合 蛋白，而另外一些没有酶活性，例如噬菌体粘附蛋白结合膜结合型细菌蛋白质。
[0006] 脂多糖（LPS)是革兰氏阴性细菌外膜的一部分，其由脂质A、核心区和0-抗原形 成。〇-抗原是细菌脂多糖最外表面暴露的部分，其由寡糖的重复单元形成，脂质A为锚定在 外膜或革兰氏阴性细菌内的区域。与脂质A和核心区相比，0-抗原是细菌脂多糖中变化最 多的部分。〇-抗原结构中的巨大变化（几百种变体）提供了将对细菌的检测深入到血清群 (serogroup)水平的一种根据。传统的细菌检测利用抗体来区分接近地相关菌株。例如， 目前在本领域中，利用不同的抗血清已经将沙门氏菌属分为具有67种不同的0-抗原的46 种血清群（一些血清群被定义为多于一种的0-抗原的组合）。大肠杆菌数据库（EC0DAB; Stenutz et al.，2006，FEMS Microbiol. Rev. 30, 382-403)列出了 178 种不同的 0-抗原。 通常通过利用大肠杆菌的抗血清的经典凝集方法来鉴定大肠杆菌的血清型。天然存在的噬 菌体利用细菌表面上的不同的受体来吸附到细菌细胞上。
[0007] 噬菌体粘附蛋白包括至少两个功能域，其中N-端区域与噬菌体结合，C-端区域与 细菌表面的受体结合。当噬菌体粘附蛋白有酶活性，例如水解细菌的0-抗原或K-抗原时， 该C-端区域也包含活性位点。然而，噬菌体粘附蛋白常包括多个域的模块式排列，经常可 以观察到不同功能部分的同源性有不同。
[0008] 在结合之后，结合0-抗原的噬菌体粘附蛋白显示出水解脂多糖0-抗原的水解活 性。所述脂多糖的水解是噬菌体侵染时多糖层侵入过程中的一部分。涉及噬菌体侵染的另 一个过程是所谓的"表面行走（surface walk)"过程。正在侵染的细菌进行所述的"表面 行走"以找到适合于DNA注入的位于细菌表面的位点。上述两个生物学过程（多糖侵入和 "表面行走"）均包括噬菌体的反复结合和释放。因此，所述噬菌体粘附蛋白和细菌表面的 O-抗原的结合是由所述噬菌体粘附蛋白的水解活性所引起的可逆的结合。
[0009] 高水平的结合亲和性使得噬菌体粘附蛋白可以用作"生物吸附剂"，实现无论是在 自然界中存在的复杂环境中，还是在生物学样品例如食品中均可以特异性地结合细菌。 [0010] 到目前为止，已经有不同的针对噬菌体粘附蛋白用作生物吸附剂的实际应用，例 如检测和鉴定单一菌株或细菌群，或者纯化细菌细胞和细胞成分。
[0011] 快速和准确的检测细菌是用来诊断和治疗人类和动物中的细菌传染，以及启动预 防措施的第一主要步骤。另外，所述检测对于控制原料和已加工食品的卫生和质量是有用 的，并且对于监控饮用水、工业用水和公共浴室用水的卫生和质量方面是有用的。此外，所 述检测对于过程监控和最优化，以及环境分析中的质量控制也是有用的。
[0012] EP1198713A2和EP1356080A1描述了用于检测和鉴定单一菌株和细菌群的方法， 其中将整个噬菌体或噬菌体蛋白质偶联在支撑物上。在对偶联的噬菌体或噬菌体蛋白质与 测试样品进行温育后，可以检测出结合到噬菌体或噬菌体蛋白质上的样品中的细菌。
[0013] 当用在微生物检测体系时，在细菌检测和鉴定方面，噬菌体粘附蛋白提供了大量 优于其它生物吸附剂（例如抗体）的优点，例如优异的特异性和出众的结合性。特异性越 高越可以降低假阳性和假阴性的数量，并且目标结合性越好可以提供的信号比噪音的比值 越好。另外，噬菌体粘附蛋白可以被固定于任何表面并且可以容易地与其它分子（例如荧 光标记）偶联。已经证实了噬菌体粘附蛋白在多种不同的应用中可以提供良好的表现，即 使是面对要求最为严格和复杂的食品领域。
[0014] 此外，细菌细胞和细胞成分的纯化对于几乎任何后续加工、分析或细胞成分的分 离均是非常重要的。EP1399551A2描述了用于纯化细菌细胞和细胞成分的方法，其中含有细 菌细胞或细胞成分的样品与整个噬菌体或噬菌体蛋白质接触。然后，所述细菌细胞或细胞 成分以及噬菌体或噬菌体蛋白质的样品与固体支撑物一起温育。温育之后，固体支撑物可 以从样品中分离，从而也将细菌细胞或细胞成分分离，该细菌细胞或细胞成分结合在噬菌 体或噬菌体蛋白质上，而噬菌体或噬菌体蛋白质结合在固体支撑物上。
[0015] 如EP1399551A2所述借助噬菌体或噬菌体蛋白质对细菌细胞和细胞成分进行纯 化，除了其它优点之外，该方法还可以自动地进行，并且因此可以整合到自动分析或分离方 法（例如质粒的纯化）中。
[0016] 然而，在天然存在的噬菌体或噬菌体蛋白质以及细菌之间存在结合平衡，这归因 于由噬菌体粘附蛋白的水解活性而产生的噬菌体粘附蛋白的可逆的结合。这个效果降低了 这类基于噬菌体的细菌分析方法的灵敏度。
[0017] 在本领域中已知的基于噬菌体的细菌分析方法中，噬菌体粘附蛋白通常是非常大 的蛋白，由多于1000个氨基酸的多肽链构成，其中所述噬菌体粘附蛋白由提供不同功能的 数个结构部分组成。噬菌体粘附蛋白的这种大小和数个结构部分的特点导致难以表达、纯 化，分离并且保存所述的噬菌体粘附蛋白。噬菌体粘附蛋白的模块区域排列还具有对蛋白 酶解敏感的风险，蛋白酶可以在噬菌体粘附蛋白的不同功能模块之间降解。这样的蛋白酶 降解引起噬菌体粘附蛋白性质的变化，并伴有蛋白质活性的丧失。
[0018] 因此，本发明的目的在于提供噬菌体粘附蛋白，其用于更有效地结合、富集、移除、 捕获和检测革兰氏阴性细菌。
[0019] 在权利要求书中限定的发明主题解决了上述目的。
[0020] 具体地，本发明涉及以下方面：
[0021] 1.特异性结合革兰氏阴性细菌0-抗原的噬菌体粘附蛋白，其中所述噬菌体粘附 蛋白与其野生型相比缺少结合噬菌体和水解脂多糖的能力。
[0022] 2.项1所述的噬菌体粘附蛋白，其包括突变和/或缺失。
[0023] 3.项2所述的噬菌体粘附蛋白，其包括噬菌体结合域的缺失和/或包括酸性氨基 酸突变为非酸性氨基酸，特别是1~7个、1~6个、1~5、1~4个、1~3个或1~2个酸 性氨基酸突变为非酸性氨基酸，以及更具体的是一个酸性氨基酸突变为非酸性氨基酸。
[0024] 4.上述项中之一所述的噬菌体粘附蛋白，其包括标志物分子或标签，所述标志物 分子优选生物素或链霉抗生物素，所述标签优选HA-标签、His-标签、Str印-标签、Avi-标 签、Myc-标签、GST-标签、JS-标签或半胱氨酸-标签。
[0025] 5.噬菌体粘附蛋白，其具有SEQ ID NO :2、4、5、7、9、11~14、36~42、56或58的 氨基酸序列；
[0026] 或噬菌体粘附蛋白，其相对于SEQ ID NO :60被截去了从氨基酸残基2直到氨基 酸残基161的N-端、且具有D332突变为N、D341突变为N、D345突变为N、E365突变为Q、 D381突变为N、E392突变为Q、D402突变为N、D405突变为N、E411突变为Q、D417突变为 N、D428突变为N、D431突变为N、E444突变为Q、E456突变为Q、D459突变为N、E483突变 为Q、E500突变为Q、E518突变为Q或D519突变为N中的至少一个突变；
[0027] 或噬菌体粘附蛋白，其相对于SEQ ID NO :62被截去了从氨基酸残基2直到氨基 酸残基161的N-端、且具有D332突变为N、D341突变为N、D345突变为N、E365突变为Q、 D381突变为N、E392突变为Q、D402突变为N、D405突变为N、E411突变为Q、D417突变为 N、D428突变为N、D431突变为N、E444突变为Q、E456突变为Q、D459突变为N、E483突变 为Q、E500突变为Q、E518突变为Q或D519突变为N中的至少一个突变；
[0028] 或噬菌体粘附蛋白，其相对于SEQ ID NO :64被截去了从氨基酸残基2直到氨基 酸残基161的N-端、且具有D340突变为N、D344突变为N、E364突变为Q、D380突变为N、 E391突变为Q、D401突变为N、D404突变为N、E410突变为Q、D416突变为N、D427突变为 N、D430突变为N、E443突变为Q、E455突变为Q、D458突变为N、E482突变为Q、E499突变 为Q、E517突变为Q或D518突变为N中的至少一个突变；
[0029] 或噬菌体粘附蛋白，其相对于SEQ ID NO :66被截去了从氨基酸残基2直到氨基 酸残基156的N-端、且具有E329突变为Q、D351突变为N、D358突变为N、E375突变为Q、 E377突变为Q、D383突变为N、D385突变为N、E393突变为Q、E401突变为Q、D446突变为 N、E468突变为Q、D487突变为N、E494突变为Q、D495突变为N、D496突变为N、E503突变 为Q、E518突变为Q或D523突变为N中的至少一个突变；
[0030] 或噬菌体粘附蛋白，其相对于SEQ ID NO :68具有D180突变为N、D186突变为N、 D190突变为N、D211突变为N、D241突变为N、E246突变为Q、D254突变为Q、D261突变为 N、D263突变为N、D265突变为N、E266突变为Q、D301突变为N、E324突变为Q、D333突变 为N、E334突变为Q、E336突变为Q、D339突变为Q或D357突变为N中的至少一个突变；
[0031] 或噬菌体粘附蛋白，其相对于SEQ ID NO :70被截去了从氨基酸残基2直到氨基 酸残基169的N-端、且具有D344突变为N、D345突变为N、E351突变为Q、E356突变为Q、 D362突变为N、D398突变为N、E405突变为Q、D408突变为N、D412突变为N、E425突变为 Q、E432突变为Q、D435突变为N、D452突变为N、E498突变为Q、D509突变为N、E511突变 为Q、D529突变为N、E534突变为Q、E538突变为Q、E547突变为Q、D554突变为N、D567突 变为N、D573突变为N、D595突变为N、E609突变为Q、D615突变为N或D636突变为N中的 至少一个突变；
[0032] 或噬菌体粘附蛋白，其相对于SEQ ID NO :72被截去了从氨基酸残基2直到氨基 酸残基107的N-端、且具有D178突变为N、D179突变为N、E185突变为Q、E190突变为Q、 D196突变为N、D232突变为N、E239突变为Q、D242突变为N、D246突变为N、E259突变为 Q、E266突变为Q、D269突变为N、D286突变为N、E332突变为Q、E345突变为Q、D363突变 为N、E368突变为Q、E372突变为Q、E381突变为Q、D388突变为N、D401突变为N、D407突 变为N、D429突变为N、E443突变为Q、D449突变为N或D470突变为N中的至少一个突变；
[0033] 或噬菌体粘附蛋白，其相对于SEQ ID NO :74被截去了从氨基酸残基2直到氨基 酸残基107的N-端、且具有D178突变为N、D179突变为N、E185突变为Q、E190突变为Q、 D196突变为N、D232突变为N，E239突变为Q、D242突变为N、D246突变为N、E259突变为 Q、E266突变为Q、D269突变为N、D286突变为N、E332突变为Q、E345突变为Q、D363突变 为N、E368突变为Q、E372突变为Q、E381突变为Q、D388突变为N、D401突变为N、D407突 变为N、D429突变为N、E443突变为Q、D449突变为N或D470突变为N中的至少一个突变。
[0034] 6.核酸分子，其编码根据上述项中之一所述的噬菌体粘附蛋白，优选如SEQ ID NO :43~51所示的序列。
[0035] 7.载体，其编码项1~5中之一所述的噬菌体粘附蛋白。
[0036] 8.宿主细胞，其被项6所述的核酸分子或权利要求7所述的载体转化。
[0037] 9.产生项1~5中之一所述的噬菌体粘附蛋白的方法，其包括以下步骤：
[0038] (a)识别噬菌体粘附蛋白的噬菌体结合域；
[0039] (b)从包含编码步骤（a)的噬菌体粘附蛋白的序列的核酸分子中删除步骤（a)识 别的噬菌体结合域；
[0040] (C)利用突变使噬菌体粘附蛋白的水解活性失活。
[0041] 10.项9所述的方法，其中在步骤（a)中，所述噬菌体结合域通过先进行氨基酸比 对，再确定所述噬菌体粘附蛋白相比另一种噬菌体粘附蛋白的N-端来识别，
[0042] 或其中所述噬菌体结合域通过用适于同源性钓取噬菌体结合域的引物扩增编码 该噬菌体结合域的核酸序列来识别。
[0043] 11.项1~5中之一所述的噬菌体粘附蛋白的用途，用于结合、富集、移除、捕获和 检测革兰氏阴性细菌。
[0044] 12.检测细菌的方法，其包括以下步骤：
[0045] (a)使项1~5中之一所述的噬菌体粘附蛋白与支撑物偶联；
[0046] (b)将偶联有所述噬菌体粘附蛋白的支撑物与样品一起温育；
[0047] (C)任选除去样品以及该样品中未结合所述噬菌体粘附蛋白的细菌；
[0048] (d)任选加入透化或破坏细菌膜的物质；以及
[0049] (e)检测样品中与所述噬菌体粘附蛋白结合的细菌。
[0050] 13.检测细菌的方法，其包括以下步骤：
[0051] (a)使含有细菌细胞或细胞成分的样品与项1~5中之一所述的噬菌体粘附蛋白 接触，优选温育约1秒~20分钟；
[0052] (b)然后将含有细菌细胞或细胞成分和所述噬菌体粘附蛋白的样品与固体支撑物 一起温育，优选约1~60分钟；
[0053] (c)任选除去样品以及该样品中未结合所述噬菌体粘附蛋白的细菌；
[0054] (d)任选加入透化或破坏细菌膜的物质；以及
[0055] (e)检测样品中与所述噬菌体粘附蛋白结合的细菌。
[0056] 14.项12或13所述的方法的用途，用于检测在医药、食品工业和分析、牲畜饲养、 新鲜水或环境分析中的细菌。
[0057] 15.选择性纯化细菌细胞或细胞成分的方法，其包括以下步骤：
[0058] a)使含有细菌细胞或细胞成分的样品与项1~5中之一所述的噬菌体粘附蛋白接 触，优选温育约1~20分钟；
[0059] b)随后将所述样品与固体支撑物一起温育，其中所述样品含有细菌细胞或细胞成 分和所述噬菌体粘附蛋白，优选温育约1~60分钟；
[0060] c)从样品中分离出结合有细菌细胞或细胞成分的固体支撑物，其中细菌细胞或细 胞成分通过所述噬菌体粘附蛋白结合到所述固体支撑物上。
[0061] 16.富集和纯化细菌细胞和/或细胞成分的方法，其包括下述步骤：
[0062] c)使含有细菌细胞和/或细胞成分的样品与磁性支撑物相接触，在所述磁性支撑 物的表面有项1~5中之一所述的噬菌体粘附蛋白，优选温育约1~60分钟；
[0063] d)从样品中分离出结合有所述细菌细胞和/或细胞成分的磁性支撑物。
[0064] 17. -种试剂盒，其用来进行项12、13、15或16所述的方法，所述试剂盒包括项 1~5中之一所述的噬菌体粘附蛋白，支撑物和用于检测、纯化或富集革兰氏阴性细菌和/ 或细胞成分的检测试剂。
【附图说明】
[0065] 下面的附图用来说明本发明。
[0066] 图1为不出大肠杆菌0111 :B4的LPS的化学结构的不意图。标记出代表LPS的三 个部分，即：脂质A、核心区和0-抗原，η =重复单元的数量；Hep = L-甘油-D-甘露糖-庚 糖；Gal =半乳糖；Glc =葡萄糖；KDO = 2-酮基-3-脱氧辛酸；NGa = N-乙酰基-半乳糖 胺；NGc = N-乙酰基葡糖胺。
[0067] 图2示出了 Ρ22尾部刺突（tail spike)和Det7尾部刺突（SBPl)的氨基酸序列的 比对。相同的氨基酸残基用表示，具有密切相关侧链的氨基酸残基用"："表示，不太密 切相关的氨基酸残基用"表示。两个序列之间显示高度同源性的氨基酸序列用下划线标 出。用黑体字体指出Det7尾部刺突的S 152,其为N-端截短变体（N-terminally truncated variant)的第一个氨基酸残基，参与活性位点的三个氨基酸残基用斜黑体来表示。
[0068] 图3示出了 ε 15尾丝和Det7 0RF790公认尾部蛋白（SBP2)的氨基酸序列的比对。 相同的氨基酸残基用表示，具有密切相关侧链的氨基酸残基用"："表示，不太密切相关 的氨基酸残基用表示。两个序列之间显示高度同源性的氨基酸序列用下划线标出。用 黑体字体指出Det7 0RF790公认尾部蛋白的S252,其为N-端截短变体的第一个氨基酸残 基。参与活性位点的D485用斜黑体来表示。
[0069] 图4示出了 P22尾部刺突和噬菌体14尾部刺突的氨基酸序列的比对。相同的氨 基酸残基用表示，具有密切相关侧链的氨基酸残基用"："表示，不太密切相关的氨基酸 残基用表示。两个序列之间显示高度同源性的氨基酸序列用下划线标出。用黑体字体 指出噬菌体14尾部刺突的K108,其为N-端截短变体的第一个氨基酸残基。参与失活作用 的酸性氨基酸残基E171、D433和D435用斜黑体来表示。
[0070] 图5示出了 ε 15尾丝和0157_BP1的氨基酸序列的比对。相同的氨基酸残基用 表示，具有密切相关侧链的氨基酸残基用"："表示，不太密切相关的氨基酸残基用" 表示。两个序列之间显示高度同源性的氨基酸序列用下划线标出。用黑体字体指出〇157_ BPl的V 163,其为N-端截短变体的第一个氨基酸残基。参与活性位点的D463用斜黑体来 表不。
[0071] 图6示出了 HK620尾部刺突和0111_BP1的氨基酸序列的比对。相同的氨基酸残 基用表示，具有密切相关侧链的氨基酸残基用"："表示，不太密切相关的氨基酸残基 用表示。两个序列之间显示高度同源性的氨基酸序列用下划线标出。用黑体字体指出 0111_BP1的K108,其为N-端截短变体的第一个氨基酸残基。与酶失活相关的D204、D277、 D302、D332、E337、D345、E354、E357、E415、D471、E476、D477、E482 和 D492 用斜黑体来表示。
[0072] 图7为银染色的Tris-Tricin梯度凝胶，其示出了 wt_Det7 0RF790与N-端截短且 失活的变体 Det7 0RF790(A 2-251，D485N)对列克星敦沙门氏菌（Salmonella Lexington) LPS的水解结果的比较。M为多肽分子量标记，LPS表示分离的、且未加入噬菌体尾部蛋白的 脂多糖，wt表示分离的、且加入了有酶活性的野生型Det7 0RF790尾部刺突的脂多糖，Det7 0RF790 ( Δ 2-251，D485N)表示分离的、且加入了具有失活突变D485N的N-端截短变体的脂 多糖。各自的温育时间用其下方标注的小时数来表示。"1"表示噬菌体粘附蛋白的条带， "2"表示在制备LPS过程的蛋白质杂质的条带。
[0073] 图8为考马斯染色的SDS凝胶，其示出了 Det7尾部刺突SBPl的三个N-端截短失 活变体在表达、可溶性和SDS稳定性组合测试中的结果。"M"表示的泳道为分子量标记，分 子量的大小在左边的空白处给出。"P"表示不可溶的沉淀组分，表示在上样之前未被煮 沸的可溶的蛋白质组分。" + "表示在上样之前被煮沸的可溶的蛋白质组分。凝胶上方给出 了表达温度30°C或37°C，以及样品经IPTG诱导（+IPTG)或未经IPTG诱导（-IPTG)。在右 边的空白处表示出蛋白条带属于单体（-M)或抗SDS三聚体（-T)。泳道1~8表示突变体 SBPl ( Δ 2-151) E406Q，道 9 ~16 表示突变体 SBPl ( Δ 2-151) D437N，泳道 17 ~24 表示突变 体 SBPl (Δ2-151)D440N。
[0074] 图9为考马斯染色的SDS凝胶，其示出了融合了不同N-端标签的0157_BP1的截 短和失活形式在表达、可溶性和SDS稳定性组合测试中的结果。"M"表示的泳道为分子量 标记，分子量的大小在左边的空白处给出。"P"表示不可溶的沉淀组分，表示在上样之 前未被煮沸的可溶的蛋白质组分。" + "表示在上样之前被煮沸的可溶的蛋白质组分。所有 的蛋白质均为截短A2-162,且具有氨基酸突变D463N。泳道2~4表示未经诱导的大肠杆 菌蛋白质背景，泳道5~7表示具有N-端Str印-标签的0157BP1，泳道8~10表示具有 N-端JS-标签的0157_BP1，泳道11~13表示具有N-端Cys-标签的0157_BP1，所有均经 IPTG诱导。两个箭头标记出噬菌体粘附蛋白的SDS抗性寡聚形式（上箭头）和噬菌体粘附 蛋白的单体形式（下箭头）的位置。
[0075] 图10为示出利用Det7尾部刺突SBPl ( Δ 2-151 ;D437N)特异性捕获血清群Dl和 B的沙门氏菌属菌株的细菌细胞的结果的图。数据棒示出