耐甲氧西林金黄色葡萄球菌快速检测的试剂盒及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物检测技术领域，具体涉及一种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌快速 检测的试剂盒及其应用。
【背景技术】
[0002] 金黄色葡萄球菌（SAU)是引起医院感染的最常见病原菌之一，随着大量广谱抗菌 药物在临床的广泛使用，医院感染金黄色葡萄球菌的耐药性也不断增强，近年来，医院感 染耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA)的分离率一直呈较高水平。
[0003] mecA基因是金黄色葡萄球菌通过转座机制获得的外来基因，编码合成ΡΒΡ2α。 mecA基因不仅介导金黄色葡萄球菌对β -内酞胺类抗生素的耐药性，而且mecA基因所在 的DNA片段SCCmec还能不断的获得积累其它的耐药基因，促进金黄色葡萄球菌多重耐药性 的发展。
[0004] 为防止MRSA的传播和滥用抗生素引起的新型耐药菌株的出现，准确快速检出 MRSA具有十分重要的意义。目前临床常采用的MRSA检测方法主要包括三类，传统敏感性 方法、自动细菌鉴定仪和分子生物学方法。传统敏感性方法中纸片扩散法（K-B法）的最大 优点是快速、简便、价格便宜，易被检验人员接受，但易造成漏检的情况。肉汤（琼脂）稀释 (MIC)法重复性好，但操作较繁琐，而且这两种方法耗时长；自动细菌鉴定仪较快速，但容 易漏检和误检。分子生物学最常用的方法是通过PCR或DNA杂交技术检测细菌基因组中是 否存在mecA基因，从而确定MRSA，该方法是目前鉴定MRSA的"金标准"。mecA基因是造成 MRSA对苯唑西林等β -内酞胺类抗生素耐药的根本原因，且主要在耐药菌中存在，所以可 以依据mecA基因鉴定MRSA。携带mecA基因的金黄色葡萄球菌包括耐药、交界性耐药以及 敏感型等多个表型，采用mecA基因方法可以避免菌株表型的影响。但并非所有的MRSA都 携带mecA基因，因此，依据mecA基因进行鉴定MRSA时，常存在假阴性结果。
[0005] 实时焚光定量 PCR 技术（Real-time quantitative Polymerase Chain Reaction 简称Real Time PCR)是在定性PCR技术基础上发展起来的核酸定量技术，在PCR反应体系 中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过Ct值和标准曲线对 样品中的DNA (或cDNA)进行定量检测的方法。该技术不仅实现了对DNA/RNA模板的定量， 而且具有灵敏度和特异性高、能实现多重反应、自动化程度高、无污染、成本低廉等特点。目 前已有多种运用定量PCR技术的试剂盒应用于临床疾病相关的病原体检测、基因分型、突 变研究等。
[0006] nuc基因为金黄色葡萄球菌基因中高保守特异性核酸序列，对其进行扩增可以判 断是否为金黄色葡萄球菌。因此现有的检测技术中利用双通道荧光定量PCR检测耐甲氧西 林金黄色葡萄球菌需要做2个PCR反应体系，或者是先通过检测是否存在nuc基因，nuc基 因阳性者则再判断是否存在 meca基因；而本发明则通过设计引物将两个基因放置在同一 个PCR反应体系中同时扩增检测，不仅可以节省成本，且检测通量是原来的一倍。
【发明内容】
[0007] 本发明需要解决的技术问题是，提供一种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌快速检测的 试剂盒。
[0008] 本发明还要解决的技术问题是，提供上述试剂盒的应用。
[0009] 未解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
[0010] 检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的引物，包括如下核苷酸序列，
[0011] (1)扩增耐甲氧西林mecA耐药基因的引物：上游引物Fl的核苷酸序列如SEQ ID NO :1所示，下游引物Rl的核苷酸序列如SEQ ID NO :2所示；
[0012] 检测耐甲氧西林mecA耐药基因的荧光探针Tl :其核苷酸序列如SEQ ID NO :5所 示；
[0013] (2)扩增金黄色葡萄球菌nuc基因的引物：其上游引物F2的核苷酸序列如SEQ ID NO :3所示，下游引物R2的核苷酸序列如SEQ ID NO :4所示；
[0014] 检测金黄色葡萄球菌nuc基因的荧光探针T2 :其核苷酸序列如SEQ ID NO :6所示。
[0015] 上述引物及探针在同一次检测中使用。
[0016] 作为优选，所述荧光探针T1，其5'端标记FAM荧光基团，3'端标记tamra淬灭基 团。
[0017] 作为优选，所述荧光探针T2,其5'端标记HEX荧光基团，3'端标记tamra淬灭基 团。
[0018] 上述检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的引物在制备检测耐甲氧西林金黄色葡萄 球菌的试剂中的应用。
[0019] 一种检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的试剂盒，该试剂盒包括如下试剂：
[0020] (I)DNA 提取试剂；
[0021] (2)PCR反应液：10XPCR缓冲液，SEQ ID NO :1~6所示的核苷酸序列10 μmol/ L，MgCl2 2mmol/L，dNTPs 0· 2mmol/L，Taq DNA 聚合酶 2U/ μ L。
[0022] 上述检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的试剂盒在检测耐甲氧西林金黄色葡萄球 菌中的应用。
[0023] 作为优选，在应用上述检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的试剂盒进行PCR扩增 时，其PCR体系为：10XPCR缓冲液5 μ L，SEQ ID NO :1 ~6 各0· 3 μ L，Template DNA 2 μ 1， dNTPs 0. 2mmol/L, MgCl2 2mmol/L，Taq DNA 聚合酶 2U，加无菌水至 50 μ L ;
[0024] PCR 扩增条件为：94°C 5min ;60 个循环，94°C 40s，60°C 40s，72°C 40s ;72°C 3min。
[0025] 上述检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的试剂盒在使用时的判断检测菌株是否为 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的方法：将金黄色葡萄球菌基因中高保守特异性核酸序列nuc 基因与耐药核酸序列mecA基因同时扩增，依据荧光探针T2(核苷酸序列如SEQ ID NO. 6所 示），判断是否存在nuc基因，若存在nuc基因，则检测的菌株是金黄色葡萄球菌；再进行下 一步判别，根据荧光探针Tl (核苷酸序列如SEQ ID NO. 5所示）判断是否为金黄色葡萄球 菌的耐甲氧西林菌株。
[0026] 该检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的试剂盒试剂盒采用聚合酶链式反应（PCR) 及荧光标记探针技术，快速定性检测出临床培养样品中金黄色葡萄球菌特有的耐热核酸酶 基因（nuc)和耐甲氧西林编码基因（mecA)，从而判断金黄色葡萄菌及其耐甲氧西林菌株的 存在。
[0027] 有益效果：利用双通道荧光定量的优点采用聚合酶链式反应及分子信标荧光探针 技术同时对金黄色葡萄球菌基因中高保守特异性核酸序列nuc基因和耐药核酸序列mecA 基因进行扩增检测，从而判断是否为金黄色葡萄球菌的耐甲氧西林菌株。该试剂盒及技术 方法具有操作简便、特异性强、敏感性高、成本低廉及高通量等优点，通过双通道荧光定量 能实现快速检测耐甲氧西林菌株，为临床治疗提供参考。
【附图说明】
[0028] 图1为1例nuc基因检测阳性结果图，阳性对照品Ct值为18,阴性对照品Ct值为 无数值；标本Ct值为27。结果判断为金黄色葡萄球菌。
[0029] 图2为1例mecA基因检测阳性结果图，阳性对照品Ct值为18,阴性对照品Ct值 为无数值；标本Ct值为"26"。结果判断为耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌菌株。
[0030] 图中横坐标为循环数；纵坐标为荧光值。
【具体实施方式】
[0031] 根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实 施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本 发明。
[0032] 实施例1 :检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌基因检测的核酸序列。
[0033] 2对特异性引物及2条探针委托英潍捷基（上海）贸易有限公司合成：
[0034] Fl(SEQ ID NO :I) :5' -tataacaacatgaaaaatgattatgg-3' ；
[0035] Rl(SEQ ID NO :2) :5' -catatgaaggtgtgct