丹参酮生物合成抑制因子基因SmJAZ3及其编码蛋白与用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程技术，特别涉及一种丹参酮生物合成抑制因子基因 SmJAZ3 及其编码蛋白与用途。
【背景技术】
[0002] 丹参（Salvia miltiorrhiza Bunge)又名赤参、紫丹参、红根等，其为唇形科 (Labiatae)鼠尾草属常用中药，以根和根茎入药，在活血化瘀，通心包络，治疝气痛的功效。 丹参酮的药理成分主要有两类，一类是脂溶性的二萜类化合物，一类是水溶性的酚酸类化 合物。丹参酮类化合物含量较高的有丹参酮I、丹参酮ΠΑ、隐丹参酮、二氢丹参酮，具有抗 肿瘤，抗菌消炎，抗氧化，抗动脉粥样硬化等多种药理活性，因此具有巨大的市场需求。酚酸 类主要成分包括原儿茶醛、迷迭香酸、丹参素、咖啡酸、丹酚酸等，均具有抗心肌缺血缺氧作 用。
[0003] 发根，也称为毛状根，其具有多种优点：单细胞起源、稳定遗传、生长快速，无需添 加外源激素等而被广泛应用。茉莉酸是茉莉花中的一种芳香物质，是香料中的常见成分。具 有共同的环戊烷酮结构的新型天然植物激素，由十八烷途径合成，在植物体内具有广泛的 生理功能，是一种重要的植物信号分子。茉莉酸及其生物活性衍生物被称为茉莉酸类物质 (Jas)。目前研究已证明，JA在植物体内发挥作用的方式是JA-Ile。可调控植物发育的多 个过程，在没有外界压力存在时，植物体内没有足够JA存在，JAZ蛋白募集下游的抑制因子 NINJA或者TPL，组蛋白去乙酰化酶HDAC，与MYC2结合，使MYC2处于失活状态，下游功能基 因的表达受到抑制；当受到环境胁迫时，植物体内合成足够的JA，在JARl的作用下可形成 JA-Ile。JA-Ile促进了 SCFC0I1与JAZ的结合，导致了 26S蛋白水解酶对JAZ的降解，使得 有活性的MYC2被释放出来，从而启动了茉莉酸响应基因的转录。
[0004] 作为一种传统的并且具有广泛药用价值的中药，丹参已经成为了国内外学者的研 究热点，但是目前对丹参的研究主要基于对其丹参酮（MEP或MVA途径）或丹酚酸关键酶 基因的研究，对丹参信号传导的研究较少。本发明主要通过克隆得到丹参JA信号途径的一 个JAZ3蛋白，通过基因工程手段，构建过表达及反义抑制载体，遗传转化丹参获得毛状根， 发现丹参JAZ3基因的表达明显影响丹参酮的代谢合成，特别是通过抑制丹参JAZ3基因的 表达可显著促进丹参酮的积累合成，获得丹参酮高产的丹参毛状根，可为商业化获取丹参 酮提供新型药源原料，目前尚未发现与本主题所提及的抑制JAZ3基因表达策略来提高丹 参酮含量的相关报道。因此，本发明在解决丹参酮药源不足问题上具有积极意义。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的，就是为了克服上述现有技术存在的缺陷，提供一种丹参酮生物合 成抑制因子基因 SmJAZ3及其编码蛋白与用途。
[0006] 本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：一种丹参酮生物合成抑制因子基因 SmJAZ3,其核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示。
[0007] 所述基因 SmJAZ3编码的蛋白质的氨基酸残基序列如SEQ ID No. 2所示。
[0008] 一种质粒，含有基因 SmJAZ3的全序列。
[0009] 一种植物过表达载体，含有基因 SmJAZ3的正向全序列。
[0010] -种植物反义抑制载体，所述植物反义抑制载体含有基因 SmJAZ3的反向全序列。
[0011] -种宿主细胞，含有基因 SmJAZ3的核苷酸序列，或含有基因 SmJAZ3的全序列，或 含有基因 SmJAZ3的正向全序列，或含有基因 SmJAZ3的反向全序列。
[0012] 本发明通过构建过表达与反义抑制载体，遗传转化丹参毛状根，对丹参中丹参酮 含量产生显著影响。本发明提供的SmJAZ3与丹参酮合成密切相关，有助于丹参药材的品质 改良，为解决丹参酮药源紧缺问题提供了一个新的作用靶点与研究思路。
【附图说明】
[0013] 图1为通过Mega6. 0建立的系统发育进化树；
[0014] 图2为发根农杆菌C58C1介导遗传转化获得的丹参毛状根；
[0015] 图3为pCAMBIA2300+-SmJAZ3转基因发根阳性克隆鉴定结果；
[0016] 图4为pCAMBIA2300+-Anti-SmJAZ3转基因发根阳性克隆鉴定结果；
[0017] 图5、图6、图7、图8为毛状根RNA的qRT-PCR分析结果；
[0018] 图9为各个样品的丹参酮含量；
[0019] 图10为丹参SmJAZ3的Z頂结构域；
[0020] 图11为丹参SmJAZ3的Jas结构域。
【具体实施方式】
[0021] 实施例1丹参SmJAZ3基因的克隆
[0022] 1、组织分离（isolation)
[0023] 取丹参植株幼嫩组织保存于-80°C冰箱
[0024] 2、RNA 的分离（RNA isolation)
[0025] 取部分组织用研钵研碎，加入裂解液匀浆后移至I. 5mL EP管中，抽提总RNA。普通 琼脂糖凝胶电泳鉴定总RNA质量，然后在NanoDrop上测定RNA含量。
[0026] 3、克隆基因全长（Cloning of Full-length cDNA)
[0027] 利用甲基茉莉酸（methyl jasmonic acid)诱导摇瓶中培养两个月的丹参毛状根， 抽提RNA，将其反转录成cDNA，利用高通量测序进行转录组分析。
[0028] 3. 1、转录组测序
[0029] 通过对丹参发根材料进行通过转录组测序，采用本地Blast策略筛选得到一条与 拟南芥JAZ3高度同源的序列，该条序列5'端完整，但3'端不完整。
[0030] 3. 2、5'端序列克隆
[0031] 根据测序的序列设计上下游引物F1、R1，通过PCR得到5'端完整序列，胶回收，回 收产物连接到18T载体，利用通用引物M13进行测序，得到SmJAZ3基因5'端的物理序列。
[0032] 3. 3、3'端序列克隆
[0033] 根据5'端完整的基因序列，设计正向特异引物F2,经过PCR(F1+AUAP)，扩增得到 3'端序列。回收，将其连接18T载体，利用通用引物M13进行测序，得到SmJAZ3基因3'端 的物理序列。
[0034] 3. 4、将测序结果比对并进行拼接，得到全长片段序列信息，并设计一对特异引物 进行PCR扩增（SmJAZ3KFl+SmJAZ3KRl)得到SmJAZ3编码区。BLAST的结果证明从丹参中新 得到的基因确为一个SmJAZ3。
[0035] 实施例2 (丹参SmJAZ3基因的序列信息与同源性分析）
[0036] 本发明的SmJAZ3基因全长cDNA的长度为101 lbp，详细序列见SEQ ID NO. 1。根 据全长cDNA推导出丹参SmJAZ3基因的氨基酸序列，共336个氨基酸残基，详细序列见SEQ ID NO. 2 〇
[0037] 丹参 SmJAZ3 与烟草（Nicotiana tabacum) jasmonate ZIM-domain protein 7b 的氨基酸序列的同源比较如表1所示。将该基因通过ClustalW、Boxshade等软件与拟 南芥JAZ基因进行多重序列比对，这条基因具有AtJAZs保守的Z頂结构，Jas结构域 (SLX2FX2KRX2RX5PY)。结果如图10、图11所示。通过Mega6. 0建立系统发育进化树，本地 Blast，发现所获得的JAZ基因与拟南芥的JAZ3同源性最高，将其命名为SmJAZ3。结果如图 1所示。
[0038] 表 1
[0039] Query I MERDFMGLS-VKQEVPDEIIDAASVRSLPMQWSFSNKGSALPQLLSFQGAQEDKQPKTG 174
[0040] MERDFMGL+ VKQEV +E ID A +RS MQffSFSN S PQ LSF+GAQED+ PKTGSbjct 1
[0041] MERDFMGLTHHVKQEVTEEPIDPAPLRSSAMQWSFSNNISTHPQYLSFKGAQEDR-PKTG 59Query 175
[0042] FNSLASSGLVTLTT-DVFDSDHSQFPA-SQKSHVPEKQGGVRYTVTTYG----------D 318
[0043] F+SLAS+GLVT+TT + DS H + QK+ + EKQGG Y TT+ Sbjct 60
[0044] FDSLASTGLVTnriEAVDSSHRSYSGVGQKN匪MQGGIBYMSTIFSPHHYDAHAMHR 119Query 319
[0045] IBNIRRAmSPA-SYAAPVAGFPVANPLOAKPSNSMVGTIOFRNSC 459 +H +R
[0046] ++PA S+ +P+ PVA+P+ A P+NSA VGTTD R + Sbjct 120
[0047] SBSWVIPVSNPMgiSVSMIlPGHKSFVSPLGONPVASPISAVPTOSAWGrroLRSAP 179Query 460
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[0049] PAQLTIFY GSVCVYD++SPEKAQAIMLLAGNA V P AT PVQA +P+ SSbjct 180
[0050] KIPPGPAQLTIFYAGSVCVYDNVSPEKAQAIM.IAGNAPPVTPSATSALSPVQAPIPKSS 239Query 640
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[0052] TTP SP+ +T SQSA KG SP AE Sbjct 240
[0053] SVDSF\WQSHNTIPTLPSPISITSHOGSQSAGVSSNTOGVTIIKSIGVLPSPSNKAELS 299Query 787
[0054] miPLGS-ASFlSSKWRKKSIARFmRKERVISASPY(HjQ 924 K +GS ΑΨ+ S VPQ RK
[0055] SLARFLEKRKERVISASPY C+Sbjct 300 KFSSSIGSVPATFVQS-AVPQARKASLARFLEKRKE RVISASPYDSCK 346
[0056] 实施例3构建过表达与反义抑制载体，遗传转化丹参毛状根
[0057] 1、构建SmJAZ3过表达及反义抑制载体
[0058] 将SmJAZ3正向及反向全长克隆到pCAMBIA2300+上，得到过表达载体 pCAMBIA2300+-SmJAZ3 及反义抑制载体 pCAMBIA2300+-Anti-SmJAZ3。
[0059] 2、发根农杆菌 C58C1 介导 pCAMBIA2300+, pCAMBIA2300+-SmJAZ3 及 pCAMBIA2300+-A nti-SmJAZ3质粒遗传转化丹参获得丹参毛状根。
[0060] (1)外植体的预培养
[0061] 剪取无菌丹参苗叶片及叶柄，接种到预培养培养基（1/2MS)上，25°C暗培养2d。
[0062] (2)农杆菌与外植体的共培养
[0063] 将上述经预培养的丹参叶片外植体，放入含活化好的上述发根农杆菌工程菌的 1/2MS悬液中浸泡10分钟（轻轻摇晃使外植体与菌液充分接触）后，取出浸染后的丹参外 植体用无菌吸水纸吸干表面菌液，转到共培养培养基1/2MS中，暗培养2d。
[0064] (3)毛状根的继代培养
[0065] 将上述的共培养2d的丹参外植体转接到除菌固体培养基（1/2MS+Ceb300mg/L) 中，25°C 16h/8h光照培养2周左右，可从外植体伤口处长出毛状根。剪下（大约l-3cm)的 毛状根，每隔2周将毛状根转移到含有不同梯度的（Cef 500mg/L，Cef300mg/L，Cef IOOmg/ L)的1/2MS培养基中继代筛选，每2周继代培养一次。经过数次继代后即可完全脱菌。再 将良好的丹参毛状根转入无抗生素的1/2MS培养基上继续暗培养。发根农杆菌C58C1介导 遗传转化获得丹参毛状根如图2所示。图中：A、无菌苗；B、无菌叶片预培养与共培养；C、初 步获得毛状根；D、得到毛状根单克隆；E、液体扩大培养。
[0066] 实施例4丹参毛状根阳性克隆鉴定
[0067] CTAB 法提取 pCAMBIA2300+、pCAMBIA2300+-SmJAZ3 及 pCAMBIA2300+-Anti-SmJAZ3 在体转化的每个克隆的基因组DNA，PCR鉴定获得毛状根阳性克隆。
[0068] 1、PCR 鉴定 pCAMBIA2300+-SmJAZ3 转基因发根
[0069] pCAMBIA2300+-SmJAZ3转基因发根阳性克隆鉴定（35SF23、JAZ3R590)阳性率 55.3% (21/38)，结果如图3所示。
[0070] 2、PCR 鉴定 pCAMBIA2300+-Anti-SmJAZ3 转基因发根
[0071] pCAMBIA2300+-Anti-SmJAZ3 转基因发根阳性克隆鉴定（JAZ3R590、N0SR)阳性率 44. 4% (16/36)，结果如图4所示。
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