一种基于改良lamp法的日本血吸虫核酸检测试剂盒及检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，涉及一种基于改良LAMP法的日本血吸虫核酸检测试 剂盒及检测方法。
【背景技术】
[0002] 血吸虫病是世界上第二大寄生虫病，是一种人畜共患的寄生虫病，流行于亚洲、非 洲和拉丁美洲的76个国家和地区，是世界上重要的公共卫生问题之一。现主要存在6种寄 生于人体的血吸虫，其中我国流行的血吸虫为日本血吸虫。日本血吸虫不仅影响个人健康， 而且影响整个血吸虫病流行区域的经济发展。我国已于2004年将血吸虫病列为乙类传染 病，与传染性非典型肺炎、艾滋病处于同等重要的防治位置。
[0003] 我国的血吸虫病分布在江苏、浙江、上海、安徽、江西、湖南、湖北、四川、云南、广 西、广东、福建等12个省（市）的433个县（市、区），共有钉螺面积148亿平方米，累计感 染者达1160万例，受威胁人口在1亿以上。经过60年的积极防治，全国的血吸虫病疫情已 得到有效控制，但近年来由于生物、自然、社会经济、人口流动、政策保障等因素变化较大， 一些地方呈现血吸虫病疫情扩散蔓延的态势，表现为老疫区血吸虫病患者增加，钉螺扩散 明显，新钉螺区出现，感染性钉螺分布范围扩大，部分已达血吸虫病传播控制和传播阻断的 地区可能出现疫情回升，各地输入性血吸虫病病例增加，说明我国的血吸虫病防治工作还 任重道远。
[0004] 国家对血吸虫病的防治非常重视，每年针对血吸虫患者及疫水要进行大量的资金 投入用于血吸虫的防控。
[0005] 目前用于血吸虫诊断的方法主要有病原学诊断、免疫学诊断和超声诊断等。传统 病原学诊断方法是诊断血吸虫病最为可靠、经典，是判断血吸虫病患病与否的金标准，尤其 Kato-Katz涂片粪检法以及毛蝴孵育法（MHT)。Kato-Katz法是从患者粪便中查找血吸虫 虫卵，较为费时、费力，且疫区群众依从性下降，且易造成漏检。MHT法包括尼龙袋法、顶管 法、集孵法与促孵法等，该方法检出率高于常规方法，但用时太长，工作量大，且同样存在不 能早期诊断和群众依从性差等问题。免疫诊断方法具有较高的敏感性以及疫区群众的依从 性较高等优点，已为广大专业人员和疫区群众所接受，并在对疫区化疗对象的大规模筛查 和血清流行病学调查以及防治效果的评价等方面起到了极为重要的作用，已形成了皮试、 尾蝴膜试验、环卵沉淀试验（C0PT)、间接血凝试验（IHA)、多种酶联免疫吸附试验（ELISA) 和直接免疫检测等方法。C0PT，对于非疫区健康人群具有较高的敏感性和较低的假阳性率， 但对疫区的反复化疗的人群其敏感性为72 %，这一方法的NPV较高（超过87 % )，而PPV较 低（32%-70%)，这一方法费时且相对复杂，需要显微镜。IHA，仍是社区诊断常规的方法， 用于化疗人群的筛选，与Kato-Katz法及MHT法相比，其敏感性高、简便、快速，然而在反复 化疗的地区，这一方法的PPV较低（低于37% )，敏感性为69-100%，特异性为35-94%， 此外这一方法同卫氏并殖吸虫有64-84%的交叉反应，这限制了其应用。ELISA法包括了 Dot-ELISA，SPA-ELISA等，其敏感性从65-100%，但是大多数报道的特异性均小于60 %， ELISA的NPV较高（超过88% )，但是大多数报道的PPV非常低。血吸虫病的超声诊断是 非损伤性诊断方法，操作简便，能准确发现肝脏血吸虫病的病理改变，可评估病情的严重程 度。在现场短期内可检查大量人群，立即可获结果，若使用标准化方法，具有可比性。但是 对于早期血吸虫病人无效。
[0006] 疫区每年都要进行大规模的疫水鉴定、灭螺工作。目前，我国对疫水的鉴定工作主 要是依靠：①收集钉螺，然后在光照条件充足的情况下孵育出毛蝴镜检；②采用"哨鼠"的 办法判定该水浴是否有尾蝴；③采集牛粪"粪检"血吸虫虫卵。从钉螺中孵育毛蝴对钉螺的 条件要求高，如果钉螺保存不当导致其体内寄生的胞蝴死亡或者活力下降，将导致假阴性 的产生；另一方面，镜检毛蝴也需要一定的专业技术，对检验人员要求较高，否则也会导致 漏检等。"哨鼠"更是一种耗时长且敏感性较低的检验方法，该方法首选选定水域，然后让小 白鼠在该水域水面游泳一定时间（4小时/天，共2天），游泳过的小白鼠经过6个周左右的 培养以后，检测该小白鼠是否感染血吸虫，从而来鉴定该水域是否疫水，"哨鼠"方法判定疫 水的工作在时间上有一种严重的滞后感，往往疫情已过而鉴定结果却还没有出来。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是提供一种用于检测日本血吸虫的引物组及其应用。
[0008] 本发明首先提供了一个引物组，由序列表的序列1所示的单链DNA分子（F3)、序列 表的序列2所示的单链DNA分子（B3)、序列表的序列3所示的单链DNA分子（FIP)和序列 表的序列4所示的单链DNA分子（BIP)组成；所述引物组的功能为如下（a)或（b) : (a)鉴 定或辅助鉴定日本血吸虫；(b)检测待测样本中是否含有日本血吸虫。
[0009] 本发明还保护所述引物组在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒的功能为如下（a) 或（b) :(a)鉴定或辅助鉴定日本血吸虫；(b)检测待测样本中是否含有日本血吸虫。
[0010] 含有所述引物组的试剂盒也属于本发明的保护范围；所述试剂盒的功能为如下 (a)或（b) : (a)鉴定或辅助鉴定日本血吸虫；(b)检测待测样本中是否含有日本血吸虫。 [0011] 所述试剂盒中还可包括其他环介导等温扩增反应的常规试剂。
[0012] 所述试剂盒中还可包括钙黄绿素和Bst DNA聚合酶。所述试剂盒中还可包括UNG 酶。所述试剂盒中还可包括溴酚蓝。LAMP反应目前存在的一大问题就是其产物对环境的严 重污染，会导致假阳性的发生。本发明中将UNG酶反应体系引入传统的LAMP反应体系中， 在同一反应体系中进行抗污染及LAMP反应，极大降低环境污染对后续检测的影响，最大程 度的降低了假阳性的发生。本发明中将显色剂钙黄绿素与辅显剂溴酚蓝结合使用，阴阳性 结果的视觉色差优于目前单纯使用显色剂钙黄绿素的视觉色差，使得结果判定更为简洁可 与巨〇
[0013] 所述试剂盒中还可包括：dNTPs、Mg离子、甜菜碱、猛离子和Bst Buffer。
[0014] 所述试剂盒具体可包括LAMP反应液、Bst DNA聚合酶和UNG酶。
[0015] 所述LAMP反应液的制备方法（22. 5 μ L)具体可为：将3 μ L IOmmol dNTPs、0. 5 μ L 10ymol/L F3、0.5yL 10ymol/L B3、lyL 40ymol/L FIP、lyL 40ymol/L BIP、1.5yL IOOmM MgSOyK溶液、I μ L 5M甜菜碱水溶液、2. 5 μ L钙黄绿素与氯化锰混合液（含I. 5mM 钙黄绿素和IOOmM 111(：12;溶剂为水）、2. 5 μ L Bst Buffer、1 μ L 10 μ M溴酚蓝溶液和8 μ L 双蒸水。
[0016] 本发明还保护所述试剂盒的制备方法，包括将所述引物组中的各条引物进行独立 包装的步骤。
[0017] 本发明还保护一种鉴定或辅助鉴定日本血吸虫的方法，包括如下步骤：
[0018] (1)提取待测血吸虫的基因组DNA ;
[0019] (2)以步骤（1)提取的基因组DNA为模板，采用所述引物组进行环介导等温扩增； 如果所述引物组可以实现以所述基因组DNA为模板的特异性扩增，待测血吸虫为或候选为 日本血吸虫；如果所述引物组不能实现以所述基因组DNA为模板的特异性扩增，待测血吸 虫为或候选为非日本血吸虫。
[0020] 所述环介导等温扩增的反应体系中可含有钙黄绿素和Bst DNA聚合酶。所述环介 导等温扩增的反应体系中还可含有UNG酶。所述环介导等温扩增的反应体系中还可含有溴 酚蓝。所述环介导等温扩增的初始反应体系中，钙黄绿素的浓度可为〇.15mM、Bst DNA聚 合酶的浓度可为0. 32U/ μ L、UNG酶的浓度可为0. 04U/ μ L、溴酸蓝的浓度可为0. 4 μ M。所 述环介导等温扩增的反应体系具体组成如下：22. 5 μ L所述LAMP反应液、1 μ L Bst DNA聚 合酶（8U)、0. 5 μ L UNG酶（IU)和1 μ L模板。所述环介导等温扩增的反应体系具体组成如 下：22. 5 μ L所述LAMP反应液、1 μ L Bst DNA聚合酶、0· 5 μ L UNG酶和1 μ L模板。
[0021] 本发明还保护一种检测待测样本中是否含有日本血吸虫的方法，包括如下步骤：
[0022] (1)提取待测样本的总DNA ;
[0023] (2)以步骤⑴提取的总DNA为模板，采用所述引物组进行环介导等温扩增；如果 所述引物组可以实现以所述总DNA为模板的特异性扩增，所述待测生物样本含有或疑似含 有日本血吸虫；如果所述引物组不能实现以所述总DNA为模板的特异性扩增，所述待测生 物样本不含有或疑似不含有日本血吸虫。
[0024] 所述环介导等温扩增的反应体系中可含有钙黄绿素和Bst DNA聚合酶。所述环介 导等温扩增的反应体系中还可含有UNG酶。所述环介导等温扩增的反应体系中还可含有溴 酚蓝。所述环介导等温扩增的初始反应体系中，钙黄绿素的浓度可为〇.15mM、Bst DNA聚 合酶的浓度可为0. 32U/ μ L、UNG酶的浓度可为0. 04U/ μ L、溴酸蓝的浓度可为0. 4 μ M。所 述环介导等温扩增的反应体系具体组成如下：22. 5 μ L所述LAMP反应液、1 μ L Bst DNA聚 合酶（8U)、0. 5 μ L UNG酶（IU)和1 μ L模板。所述环介导等温扩增的反应体系具体组成如 下：22. 5 μ L所述LAMP反应液、1 μ L Bst DNA聚合酶、0· 5 μ L UNG酶和1 μ L模板。
[0025] 所述待测样本为离体的生物样本或水样。所述离体的生物样本为血液、肌肉等。所 述离体的生物样本为家兔的离体样本、钉螺的离体样本等。
[0026] 以上任一所述环介导等温扩增的反应条件具体如下：37 °C 20min，然后 65 °C 60min〇
[0027] 以上任一所述日本血吸虫可为成虫、幼虫或虫卵。
[0028] 血吸虫病的核酸诊断理论上是最佳的诊断方法，它既可有效地确诊血吸虫病患者 又可对环境中的感染因素（包括钉螺、疫水及牛粪）中是否含有血吸虫做出判定。
[0029] 应用本发明提供的引物组或试剂盒检测日本血吸虫，具有灵敏性高、特异强、操作 简便快捷、用时短（I. 5h)、不依赖特殊仪器（仅需恒温水浴锅即可）、结果判断简洁（只需 肉眼观察即可）、检测全程反应管不开盖、无污染等优点，非常适于在日本血吸虫疫源地进 行环境评估以及在医院进行临床诊断。本发明对于血吸虫的发生监测和防控具有重大的应 用价值。
【附图说明】