抗人Delta like 4单克隆抗体及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种新的可与人新生血管内皮顶端细胞表面 的Delta like 4(D114)特异结合的高亲和力单克隆抗体，以及抗D114单克隆抗体可变区 序列及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 1975年Koehler和Mi Istein创立了体外杂交瘤技术得到了鼠源性单克隆抗体，开 始了多克隆抗体走向单克隆抗体的新时代。与多克隆抗体相比，单克隆抗体具有无可比拟 的优越性，它具有特异性高、效价高、纯度高、理化性状均一、重复性强、成本低并可大量生 产等优点。单克隆抗体的这些特征使它成为未来治疗学上研究的热点。
[0003] 肿瘤的生长和迀移需要有宿主的血管延伸至肿瘤组织内部。由于Notch信号在血 管发育和生成中发挥着重要的调节作用，因此，Notch信号通路的原件可以成为治疗肿瘤血 管生成的靶标。在很多肿瘤血管中都可以观察到D114的高表达，研究表明，D114被鉴定为 有效的抗肿瘤血管生成的重要靶标。
[0004] 近年的研究发现，D114/Notch参与肿瘤血管的生成和肿瘤干细胞的更新。通过对 给予抗D114抗体或D114-Fc等融合蛋白，可以阻断D114/Notch信号的传导，可以抑制多种 实体瘤在小鼠体内的生长。在这些肿瘤组织内部，虽然肿瘤血管的密度增加，但是这些新生 成的血管缺乏与成熟的血管丛有效的融合，不能为肿瘤组织提供血流，因此可以有效地抑 制肿瘤的生长。有研究表明，抗D114单克隆抗体甚至可以杀伤对抗VEGF-A抗体拮抗的肿 瘤。D114/Notch参与一系列癌症干细胞的分化、增殖、更新和维持癌症干细胞的表型，如， 乳腺癌、胚胎脑癌、胶质瘤、肝癌和前列腺癌。Hoey等联合使用抗人D114单克隆抗体和抗 鼠 D114单克隆抗体对荷瘤N0D/SCID小鼠进行治疗发现，通过降低小鼠瘤组织内部肿瘤干 细胞的比例，抑制肿瘤组织的生长，降低肿瘤细胞的转移和延迟肿瘤的复发。
[0005] 本发明以重组人D114(rhD114)胞外区为抗原，通过杂交瘤技术筛选制备了高亲 和力的抗D114特异性单克隆抗体，并通过体内外实验证明了其高效生物学活性。
【发明内容】
[0006] 发明目的
[0007] 本发明提供一种具有促进无功能血管生成以及抗肿瘤药效的抗D114特异性单克 隆抗体。本发明单克隆抗体的特征为特异性结合D114胞外区，阻断D114-Notch信号通路。
[0008] 技术方案
[0009] 本发明提供了一种抗D114单克隆抗体，及其相关蛋白质和核苷酸序列。
[0010] 本发明提供了一种抗人D114单克隆抗体，以D114胞外区段为抗原，通过杂交瘤技 术，筛选制备高亲和力的抗D114特异性单克隆抗体，具有潜在医学和药学价值。
[0011] 本发明提供制备上述单克隆抗体的制备方法。
[0012] 本发明同时提供一种DNA分子，该DNA分子含有SEQ ID NO: 1，17, 33或49所示的 编码所述单克隆抗体重链可变区的核苷酸序列，以及SEQ ID N0:9,25,41或57所示的编码 所述单克隆抗体轻链可变区的核苷酸序列。
[0013] 本发明提供一种抗D114单克隆抗体，它包含重链可变区和轻链可变区，其特征在 于，重链可变区具有SEQ ID NO: 2,18, 34或50所示的氨基酸序列，轻链可变区具有SEQ ID NO: 10, 26,42或58所示的氨基酸序列。
[0014] 本发明提供了抗D114单克隆抗体的重链互补决定区⑶R1XDR2和⑶R3及轻链可 变区⑶RU⑶R2和⑶R3的氨基酸和核苷酸序列。
【附图说明】
[0015] 图 1 是 Western Blot 鉴定抗 D114 单克隆抗体 MMGZ01、MMAH06、MMZL03 和 MMCE08 图。
[0016] 图2是抗原抗体亲和力拟和曲线图，分别展示抗Dl 14单克隆抗体MMGZOI、MMAH06、 MMZL03和MMCE08与抗原D114的结合测试实验（Biacore)。
[0017] 图3是柱形图，描述抗D114单克隆抗体MMGZ01、MMAH06、MMZL03和MMCE08阻断 Dl 14对人脐静脉内皮细胞的增殖抑制作用。
【具体实施方式】
[0018] 下面将结合实施例进一步详细地描述本发明。然而应当理解，列举这些实施例只 是为了起说明作用，而并不是用来限制本发明。
[0019] 实施例1 :抗D114单克隆抗体的制备：
[0020] (1)免疫小鼠
[0021] 本单克隆抗体的筛选制备是以重组人D114(购自北京义翘神州）为免疫原，用PBS 溶解重组抗原，与quick antibody佐剂等体积混合，免疫6周龄BALB/c小鼠，免疫流程参 照Quick Antibody说明书进行。21天后以同样方式加强免疫一针。第35天按常规方法 进行抗原冲击免疫。各次免疫一周后，采用毛细管取血法眼眶取血500 μ 1。全血室温静止 Ih后，于4°C、4000rpm离心15min，收集上层血清，并用间接ELISA测定小鼠效价。检测结 果显示免疫小鼠血清效价为1:200000。
[0022] (2)细胞融合
[0023] 收集骨髓瘤细胞及脾脏细胞，充分混合，离心共沉淀，在37°C水浴条件下，融合剂 为PEG(MW1450, sigma)进行细胞融合。融合时间3分钟后加入新鲜无血清培养基终止融 合。并用HAT培养液重悬细胞。将细胞加入已铺有滋养细胞的96孔板中。置37°C，5% CO2 培养箱中培养。融合后7天后，改用含有HT培养液全换液。24h后吸取细胞培养上清，间接 ELISA检测筛选阳性克隆。
[0024] (3)克隆筛选
[0025] 第14天取出上清液，用间接ELISA法测定抗体表达情况。在克隆化前24h制备饲 养细胞，将ELISA检测阳性孔中的细胞轻轻吹起，并将悬浮的细胞转入24孔板的一个孔，补 加 Iml DMEM完全培养基，并把24孔板置于37 °C培养箱中培养。当24孔板中的细胞长到 25%~50%汇合度时，将孔内杂交瘤细胞轻轻吹起，稀释至10个/ml。将细胞悬液移种至 己铺有饲养细胞的96孔培养板内，每孔100 μ 1，即平均1个细胞/孔。将培养板置入5% C0237°C恒温培养箱中培养。培养7~10天后，观察孔内细胞的生长情况，对只有单克隆生 长的细胞培养孔做好标记，同时做好记录，期间要注意换液，不能使孔内培养基变黄。待克 隆细胞生长至1/3~1/2培养孔底面积时，取培养上清进行检测。用同样方法对阳性孔进 行共3次克隆化，直至达到100%孔均为抗体阳性克隆为止，最后得到4株抗D114单克隆细 胞株。
[0026] 实施例2 :抗D114单克隆抗体可变区基因的扩