用于检测艰难梭菌的四环素耐药基因（tet M）的LAMP试剂盒及其专用引物的利记博彩app
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域中基因的分子生物学检测，特别是设及一种用于检测艰 难梭菌的四环素耐药基因（tetM)的LAMP试剂盒及其专用引物与检测方法。
【背景技术】
[0002] 艰难梭菌（Clostridiumdifficile,Cd)是一种革兰氏阳性厌氧芽抱杆菌，部分产 毒菌株通过分泌毒素A、毒素BW及二元毒素引起抗生素相关性腹泻、结肠炎甚至致死性伪 膜性肠炎，统称为艰难梭菌感染（Clostridiumdifficileinfection,CDI)。在医院获得感 染性腹泻所明确的病原体中，W艰难梭菌最为常见；在抗生素相关性腹泻病因中，艰难梭菌 亦占15% -25% ;而伪膜性肠炎则几乎100%由艰难梭菌所致。目前，CDI的一线治疗药物 是甲硝挫和/或万古霉素，大量研究发现：甲硝挫疗效降低并出现耐药菌株，万古霉素敏感 性降低，导致艰难梭菌相关性腹泻（Clostridiumdifficileassociateddisease,CDAD) 耐药率高、复发率高、难治率高、死亡率高、医疗费用高。艰难梭菌流行株对多种抗菌药物 均有耐药性，而大量抗菌药物不合理使用是导致CDI最主要的危险因素。广州李永强等报 道艰难梭菌多重耐药情况普遍，Ξ重及W上耐药株占80% (李永强，憂玉强，杨银梅.临 床分离艰难梭菌的耐药性分析[J].胃肠病学和肝病学杂志，2010, 19(10) :922-925);英国 Mutlu等报道艰难梭菌的某些型别菌株双重及Ξ重耐药率高达52. 6% -95. 4% (Mutlu，E. andA.J.Wroe,etal. (2007)."Molecularcharacterizationandantimicrobial susceptibilitypatternsofClostridiumdifficilestrainsisolatedfrom hospitalsinsouth-eastScotland."JMedMicrobiol56(Pt7):921-9.)。艰难梭菌尤 其对四环素类、林可霉素类、哇诺酬类、利福霉素类及一线药物的耐药性不断增强。
[0003] 四环素是一种广谱抗菌药物，包括天然品金霉素、±霉素、地美环素等，W及半合 成品多西环素、米诺环素等，由于它高效、低毒、价廉而广泛用于动物及人类临床疾病的防 治中。四环素对细菌的耐药机制包括：主动外排、核糖体保护、产生灭活酶及一种未明机 审IJ。经研究发现四环素耐药基因多位于接合质粒或接合转座子上。四环素对革兰阴性菌 的耐药机制W主动外排为主，主要与tetA、tetB和tetC等基因有关；而四环素对革兰 阳性菌的耐药机制则W核糖体保护为主，主要与tetW、tetK、tet^tetΜ和tet0等 基因有关。四环素类抗生素与艰难梭菌的核糖体结合，阻止氨基酷tRNA进入核糖体A位 而抑制细菌蛋白质合成，从而发挥抑菌、杀菌作用。艰难梭菌对四环素的主要耐药基因为 tetM，而tetΜ为核糖体保护蛋白，存在于细胞质中，保护核糖体免受四环素类药物的作 用，具有核糖体依赖的=憐酸鸟巧（GT巧水解酶活性，使四环素和核糖体结合能力减弱，从 而产生耐药。大量国内外研究表明，艰难梭菌对四环素耐药率较高。上海黄海辉等报道 110株艰难梭菌中对四环素的耐药率为62. 7%，tetΜ基因检出率为97. 1 %化uang，H.and A.Weintraub,etal. (2010)."Antimicrobialsusceptibilityandheteroresistance inChineseClostridiumdifficilestrains."Anaerobe16 (6):633-5.);意大利 Spigaglia等报道90株艰难梭菌中对tetΜ基因检出率为21. 1% (Spigaglia,P.and F.Barbanti,etal. (2006)."Newvariantsofthetet(M)geneinClostridiumdiffici leclinicalisolatesharbouringTn916-likeelements."JAntimicrobChemother 57化）：1205-9.)。综上所述，国内艰难梭菌对四环素耐药率和tetM基因检出率普遍较高， 故在临床使用四环素类药物时，应注意对患者密切观察和监测，一旦出现腹泻，应及时检测 艰难梭菌及其毒素，并作出相应处理，W防出现严重的伪膜性肠炎。
[0004] 目前，国内最常用PCR检测tetΜ基因，但因实验设备要求高、操作复杂、速度慢， 扩增完成后需要对产物进行电泳、显影等一些繁琐步骤，不适合基层医院及现场快速检测 的应用。因此，寻找快速、特异、敏感检测艰难梭菌中的四环素耐药基因（tetΜ)有利于控 制CDI危险因素，指导临床诊疗。 阳0化]随着分子诊断技术的不断进步，T.Notomi发明的一种新型核酸扩增技术一环介导 恒溫扩增技术（LAMP),该技术针对祀基因的6个区域设计4条特异引物，在恒溫化3-67Γ) 的条件下，利用高活性链置换DNA聚合酶度StDNA聚合酶），使得链置换DNA合成在不 停地自我循环，大量合成目标DNA的同时伴随有副产物一白色的焦憐酸儀沉淀产生，从而 实现对目的基因的快速检测（NotomiT,OkayamaH,MasubuchiH,etal.Loop-mediated isothermalamplificationofDNA.NucleicAcidsRes2000 ;28(12) :63.)。该方法检测 时间短（30-60min)，无需特殊仪器，操作简便，配合相应显色试剂还能实现肉眼判别结果。 LAMP方法目前已经成功应用于临床诊断流行细菌或病毒的定性和定量检测、胎儿性别鉴定 等，成为常用的临床快速检验方法之一。但是迄今为止，市场上还未见用于检测艰难梭菌的 四环素耐药基因（tetM)的LAMP试剂盒及其专用引物。
【发明内容】
[0006] 本发明提供了用于对艰难梭菌的四环素耐药基因（tetM)进行LAMP检测的引物， W实现艰难梭菌的四环素耐药基因（tetM)的批量检测，提高检测的特异性和灵敏度。
[0007] 本发明所提供的用于检测艰难梭菌的四环素耐药基因（tetM)的LAMP引物，是 根据艰难梭菌的四环素耐药基因（tetM)(GenBank:AB054984. 1)的特异性保守祀序列设 计的，用W定性检测肌肉、血液、粪便等样品中的艰难梭菌的四环素耐药基因（tetM)，所述 LAMP引物由五条引物组成，包括外引物tetM-F3和tetM-B3、内引物tetM-FIP和tet M-BIP化及环引物tetM-LB的组合；所述艰难梭菌的四环素耐药基因（tetΜ)的特异性保 守祀序列如序列表中SEQIDNO:1所示。
[000引具体来讲，所述用于对艰难梭菌的四环素耐药基因（tetM)进行LAMP检测的五条 引物的核巧酸序列如序列表中沈QIDN0:2(tetM-F3)、沈QIDN0:3(tetM-B3)、沈QID N0:4(tetM-FIP)、沈QIDN0:5(tetM-BI巧和沈QIDN0:6(tetM-LB)所示。
[0009] 所述的LAMP引物，为外引物tetM-F3和tetM-B3、内引物tetM-FIP和tetM-BIP 及环引物tetM-LB按摩尔比1 :8 :3的组合物。
[0010] 本发明的第二个目的是提供一种用于对艰难梭菌的四环素耐药基因（tetΜ)进行 LAMP检测的试剂盒。
[0011] 本发明所提供的试剂盒，包括上述用于对艰难梭菌的四环素耐药基因（tetM)进 行LAMP检测的引物。
[0012] 具体来讲，所述试剂盒包括W下用于23μΙ反应体系（不含模板）的试剂： MixUire 20. 9yL(主要成分包括：2mM Tris·肥1(抑8. 8)0. 7yL，10mM KC1 3. 8yL， 10mM(NH4)2S〇4 3.8yL，0.1%Tween20 0.4yL，0.8M甜菜碱化etaine)0.3yL，8mM MgS〇4 3 μ L, 1. 4mM dNTP each 0. 5 μ L，8U Bst DM polymerase 1 μ L，（1地2〇7. 4 μ L)，引物加 入量分别为：①50mM引物tet M-F3 0. 1化，使终浓度为5pmol;②50mM引物tet M-B3 0. 1 μ L，使终浓度为5pmol;③50mM引物tet M-FIP 0. 8 μ L，使终浓度为40pmol;④50mM 引物tet M-BIP 0. 8 μ L，使终浓度为40pmol⑥50mM引物tet M-LB 0. 3 μ L，使终浓度为 ISpmol。
[0013] 为方便检测，所述试剂盒中还可包括阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为含四 环素耐药基因（tetM)的艰难梭菌基因组DNA，所述阴性对照为不含DNA的LAMP扩增体系 (如双蒸水、去离子水）。
[0014] 上述LAMP引物或试剂盒在艰难梭菌的四环素耐药基因（tetM)的LAMP检测中的 应用也属于本发明的保护范围。
[0015] 本发明的第Ξ个目的是提供上述LAMP引物或试剂盒在艰难梭菌的四环素耐药基 因（tetM)的LAMP检测中的应用。
[0016] 该应用设及艰难梭菌的四环素耐药基因（tetM)的LAMP检测，可包括W下步骤：
[0017] 1)W待