一种高效全细胞催化鹅去氧胆酸合成熊去氧胆酸的方法
【技术领域】：
[0001] 本发明提供一种高效全细胞催化碟去氧胆酸合成熊去氧胆酸的方法。本发明属于 生物工程技术领域。
【背景技术】：
[0002] 熊去氧胆酸化UDCA)是名贵中药熊胆所含的主要有效成分，它与其相应的非对 映异构体碟去氧胆酸（II，CDCA)在临床上用于治疗各种胆石疾病，各种急性、慢性肝病，具 有良好的效果。从人工养殖的熊的熊胆中提取UDCA收率低，来源有限，而且有违于动物保 护，因而人工合成UDCA具有重要意义。UDCA的合成方法主要有全化学法合成和化学酶法相 结合的方法，起始原料为动物来源的胆酸（CA)或去氧胆酸（如CDCA)。
[0003]
[0004] (I)熊去氧胆酸扣DCA) 阳0化]
[0006] (II)碟去氧胆酸（CDCA)
[0007]
[0008] (III)胆酸（CA)
[0009]
[0010] (IV) 3 α -径基-7-氧代-5 β -胆烧酸（7KLCA)
[0011] UDCA的经典化学合成方法如下。因为化学氧化是非选择性的，所W必须借助醋化 来保护3α-和7α-径基。此外，7-酬基石胆酸（7-KLCA)的还原用到金属钢或者Pd/C催 化氨化，选择性低，工业化放大生产不容易控制且不安全。
[0012]
[0013]PCT/EP2009/002190里描述（如下）使用12α-类固醇脱氨酶（12α-HSDH)选择 性地将胆酸（CA)氧化成12酬-去氧胆酸（12酬-CDCA)，避免了两个保护步骤，但是仍然需 要7-KLCA的还原步骤。
[0014]胆酸一 12-酬-CDCA一CDCA一 7-KLCA一UDCA
[0015]Monti,D.,等（AdvancedSynthesis&Catalysis2009, 351, 1303-1311)描述了另 外一种酶促转化方法。首先通过来自脆弱杆菌ATCC25285的7α-服畑和12α-服DHUetra he化on, 2006, 62 (18) : 4535-4539)将CA氧化成 7,12-二酬-LCA，然后通过梭菌ATCC27555 的 70-服DH度iochimBio地ysActa，1981，665(2):262-269)的还原而形成 12-酬-UDCA， 最后通过wolff-kishner还原反应获得终产物。整个反应需要Ξ种酶的参与，W及相关辅 酶的再生系统（乳酸脱氨酶和葡萄糖脱氨酶），使得整个过程比较复杂。而且因为催化反应 的平衡问题，完全转化是不可能的。 阳016] CA- 7,12-二酬-LCA- 12-酬-UDCA-UDCA
[0017]Hirano和Masuda描述了来自产气柯林斯菌ATCC25986的NADP+依赖性的 7 0-服DH(ApplEnvironMicrobiol, 1982, 43 巧）：1057-1063),但是没有公开序列信息。 2007年ATCC25986基因组测序完成，2011年Rolf化Schmid和德国细胞制药公司将此 7 0-HS畑基因高效表达于大肠杆菌中，鉴定了它的酶学性质并用于还原7,12-二酬-LCA或 者 7-KLCA获得 12-酬-UDCA或者UDCA(ApplMicrobiolBiotechnol, 2011，90:127-135)， 发现此酶表现出高的选择性不会形成副产物。德国细胞制药公司在此序列基础上继续优化 得到了活性提高和去除底物抑制的突变子（CN201080062617,CN201180067680)，重组产生 的酶7β-服DH的高转化率和高专一性使得UDCA的酶法大规模生产成为可能。此外，华东 理工大学许建和从扭链瘤胃球菌RuminococcustorquesATCC35915克隆并高效表达了其 7β-服DH基因，UDCA的酶法合成试验证明了此酶也具有与产气柯林斯菌来源的7β-服DH 相似的、对底物7-KLCA的高转化率和高特异性。尽管如此，上述由不同来源的7β-服畑催 化的UDCA的合成反应，使用低的底物浓度（4~40g/L),而且在40g/L的底物浓度下转化 率只有90%,产品收率仅71 %。一般情况下，酶转化工艺使用lOOg/L或者更高底物浓度， 且转化率要接近100%，才可视为具有工业化生产的意义，故表明此酶促反应离工业化大 规模生产还有一定的距离。此外，上述不同的UDCA的酶促合成反应中使用的底物7-KLCA 依然依赖于碟去氧胆酸的化学氧化；反应中使用游离酶，因为整个反应需要多种酶与辅酶 德的参与，使得整个过程比较复杂而在工业化生产中难W实现。
【发明内容】
[0018] 本发明的目的是获得一种高效全细胞催化碟去氧胆酸合成熊去氧胆酸的方法。设 及一种在大肠肝菌细胞中高效表达双酶的方法，使用运种方法构建的共表达7α-类固醇 脱氨酶（7α-HS畑）和乳酸脱氨酶（L畑）的重组大肠杆菌，W及构建的共表达70-类固醇 脱氨酶（7β-服畑）突变子和醇脱氨酶（LKA畑）的重组大肠杆菌；本发明也包括上述酶基因 序列、编码的酶蛋白序列、产生此类酶的方法，W及上述重组大肠杆菌全细胞在胆酸化合物 的酶促合成中，特别是在熊去氧胆酸扣DCA)合成中的用途；此外，本发明也包括使用全细 胞合成UDCA的新方法，W及UDCA的后提取方法。
[0019] 技术方案
[0020] 一种串联形成双基因表达模块，其特征在于双基因表达模块为模块1或模块
[0021] 2;其中所述模块 1 的序列依次由SeqIDNO:1，SeqIDN0:5,SeqIDNO:
[0022] 2,SeqIDNO:3 组成；所述模块 2 的序列依次由SeqIDNO:1，SeqIDNO:
[0023] 9, Seq ID NO:2, Seq ID NO:7组成。
[0024] 一种重组大肠杆菌，其特征在于含有权利要求1所述的模块1。
[00巧]一种重组大肠杆菌，其特征在于含有权利要求2所述的模块2.
[00%] -种高效全细胞催化碟去氧胆酸合成熊去氧胆酸的方法，其特征在于由如下步骤 实现：
[0027]A、采用含有模块1的重组大肠杆菌细胞催化底物碟去氧胆酸CDCA合成3α-径 基-7-氧代-5β-胆烧酸7-KLCA，反应液酸化后得到3α-径基-7-氧代-5β-胆烧酸 7-KLCA粗品，同时采用乳酸脱氨酶及丙酬酸钢使得辅酶循环再生；
[0028] Β、采用含有模块2的重组大肠杆菌细胞催化步骤A中所述的3α-径基-7-氧 代-5β-胆烧酸7-KLCA粗品，反应液液酸化过滤后得到UDCA粗品，同时采用醇脱氨酶及异 丙醇使得辅酶循环再生。
[0029] 所述的一种高效全细胞催化碟去氧胆酸合成熊去氧胆酸的方法，其特征在于所述 的熊去氧胆酸粗品在有机溶剂中加碱溶解、回流、过滤除去固形物W及酸化分离的获得精 制成品。
[0030] 具体介绍如下： 阳031] -种如附图2所示，使用单一启动子和双核糖体结合位点巧ibosomeBinding site,RB巧在大肠杆菌中实现双基因高效共表达的方法，其特征在于所述的每个基因前有 一段包含核糖体结合位点的序列W实现双基因的高效表达，此序列如SeqIDNO: 1和Seq IDN0:2。使用上述方法构建的共表达7α-类固醇脱氨酶（7α-HS畑）基因和乳酸脱氨酶 (LDH)基因的重组大肠杆菌，其中7α-类固醇脱氨酶基因来源于大肠杆菌巧scherichia coli)K-12,基因序列如SeqIDN0:3所示，其编码的蛋白序列如SeqIDN0:4;乳酸脱氨酶 基因来源于魏斯氏菌（Weissellasp.)，基因序列如SeqIDN0:5所示，其编码的蛋白序列 如SeqIDNO:6。
[0032] 上述重组大肠杆菌细胞的应用，其特征在于所述的使用全细胞催化碟去氧胆酸 CDCA合成熊去氧胆酸UDCA前体3α-径基-7-氧代-5β-胆烧酸7-KLCA，反应中所需要的 辅酶由细胞自身的乳酸脱氨酶催化丙酬酸钢而合成，从而实现辅酶的循环再生。 W33] 使用上述方法构建的共表达70-类固醇脱氨酶（70-服畑）基因和醇脱氨 酶（LKADH)基因的重组大肠杆菌，其中70-类固醇脱氨酶基因为来源于活波瘤胃菌属 (Ruminococcusgnavus)的突变子，基因序列如SeqIDN0:7所示，其编码的蛋白序列如Seq IDΝ0:8;密码子优化的醇脱氨酶基因来源于高加索酸奶乳杆菌化actobacilluskefir)， 基因序列如SeqIDN0:9所示，其编码的蛋白序列如SeqIDNO: 10。
[0034] 上述重组大肠杆菌细胞的应用，其特征在于所述的使用全细胞催化3α-径 基-7-氧代-5β-胆烧酸7-KLCA合成熊去氧胆酸UDCA，反应中所需要的辅酶由细胞自身 的醇脱氨酶催化异丙醇而合成，从而实现辅酶的循环再生。
[0035] 一种熊去氧胆酸的合成方法，其特征在于采用上述重组大肠杆菌细胞催化底物碟 去氧胆酸CDCA合成3α-径基-7-氧代-5β-胆烧酸7-KLCA，反应液酸化后得到7-KLCA粗 品，同时采用所述乳酸脱氨酶（LDH)及丙酬酸钢使得辅酶循环再生；其特征也在于采用所 述的重组大肠杆菌细胞催