一种定点突变改造的酵母二肽基肽酶iii的利记博彩app
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种二肤基肤酶III，特别设及一种定点突变改造的酵母来源的二肤 基肤酶ΙΠ。
【背景技术】
[0002] 二肤酶III(DPPsIII，EC3.4. 14. 4)，如来自酵母的二肤酶III、来自人类的二肤 酶III、来自大鼠的二肤酶III、来自兔的二肤酶III等，是一组分子内含有特殊的肥XXGH 锋指结构的金属蛋白酶，具有水解多肤链的氨基末端切掉二肤的肤酶。DPPIII在生理功能 上与脑啡肤和血管紧张素II、血管紧张素III、促黑色素等重要的生理活性肤的新陈代谢 有关。DPPs存在于各种哺乳动物的组织中，根据亚细胞的定位、特异性地无核抑制剂的敏 感性，二肤基肤酶分成不同的类型DPPI~DPPIV。DPPIII可W选择性地从多肤链或蛋 白质的N-末端水解掉二肤残基，如：Arg-Arg-，Ala-Arg-，或者Tyr-Gry。酵母来源的DPP III由712个氨基酸组成，锋离子是其催化金属离子。其氨基酸序列与黄曲霉毒素单加氧酶 (Aflatoxinmonooxygenas，AFMO)的同源性达到37%，但不具有对6-甲氧基双巧喃香豆素 氧化分解的功能。
[0003] 黄曲霉毒素主要是由黄曲霉和寄生曲霉等真菌产生的剧毒性次生代谢产物，已经 确定的黄曲霉毒素分子的结构主要有八种，其中毒性最强的黄曲霉毒素B1 (也称6-甲氧 基双巧喃香豆素）被认为是潜在的对人类危害极为突出的一类强致癌诱变剂，一次大量摄 入会引起人及动物的急性中毒、甚至死亡；小剂量长期摄入会致崎、致突变和致癌，即使几 十ppb的含量仍有极大的毒性；I族黄曲霉毒素含有巧喃双键结构。目前，已经发现的对 6-甲氧基双巧喃香豆素具有分解作用的生物酶极少。黄曲霉毒素单加氧酶（AFM0)是一个 对6-甲氧基双巧喃香豆素有氧化分解作用的酶。经研究发现黄曲霉毒素单加氧酶氧化分 解6-甲氧基双巧喃香豆素的过程为：从底物分子中获得电子传递给氧，使水还原成过氧化 氨，将底物氧化并进一步使分子中的巧喃双键开环。在运个过程中，由分子内的变价离子的 价态变化来实现电子的传递，首先，结合在AFM0上的二价金属离子夺得底物的一个电子， 自身变成一价离子，然后不稳定的一价离子将夺得的运个电子传递给氧，自身又转变成稳 定的二价离子，氧气分子获得一个电子在水分子的参与下生成过氧化氨，同时底物转变为 它的环氧化物。然后，该环氧化物伴随着过氧化氨的作用发生氧化水解反应，最终使底物分 子中的巧喃双键断开。黄曲霉毒素单加氧酶是目前已报道的用于黄曲霉毒素解毒的生物 酶。因此，发现和制造新的对6-甲氧基双巧喃香豆素具有氧化分解作用的酶，对发展黄曲 霉毒素消减技术具有十分重要的现实意义。
【发明内容】
[0004] 本发明的首要目的是提供一种定点突变的酵母二肤基肤酶III，该酵母二肤基肤 酶III突变体对6-甲氧基双巧喃香豆素具有氧化分解功能。 阳0化]本发明所述的一种定点突变改造的酵母二肤基肤酶ΙΠ是由氨基酸序列为SEQID NO. 1的来源于酵母SaccharomycescerevisiaeS288c的酵母二肤基肤酶III(NCBI数据库 登录号为NM_001183312)中制造多个氨基酸取代而产生的、对6-甲氧基双巧喃香豆素有氧 化分解作用的酵母二肤基肤酶III突变体，所述的氨基酸取代包括第570、572和574位的 取代。
[0006] 根据本发明所述的定点突变改造的酵母二肤基肤酶III的进一步特征，所述第 570位的氨基酸用丙氨酸（Alanine，ALa，A)取代赖氨酸（Lysine，Lys，K);第572位的氨基 酸取代是用赖氨酸化ysine，Lys，K)取代甘氨酸（Glycine，Gly，G);第574位的氨基酸取代 是用组氨酸化istidine,化s，H)取代色氨酸（T巧ptophan，T巧，W);所述的定点突变改造的 酵母二肤基肤酶III突变体的氨基酸序列为SEQIDNO. 2。
[0007] 经实验验证，本发明所述的定点突变改造的酵母二肤基肤酶III(W下缩写为 "myDPP")具有对于6-甲氧基双巧喃香豆素的氧化分解功能。该突变体酶在抑6.0、反应 溫度25°C处理6-甲氧基双巧喃香豆素（lOOppb) 50分钟后，其对6-甲氧基双巧喃香豆素的 氧化分解效率达到90%。该突变体酶的其它酶学性质与野生酶相似。
[0008] 进一步地，本发明提供了一种DNA分子，其编码本发明所述的定点突变改造的酵 母二肤基肤酶III。
[0009] 优选地，本发明所述的DNA分子的核巧酸序列为SEQIDNO. 3。
[0010] 本发明的另一个目的是提供一种载体，其含有本发明所述的DM分子。
[0011] 本发明的又一个目的是提供一种宿主细胞，其含有本发明所述的DNA分子，或者 含有本发明所述的载体。
[0012] 上述载体和宿主细胞都可W通过本领域公知的技术手段进行制备。
[0013] 本发明还提供了本发明所述的定点突变改造的酵母二肤基肤酶III的生产方法， 包括：在适于二肤基肤酶III表达的条件下培养本发明所述的宿主细胞，并从培养基中分 离所述的酵母二肤基肤酶III。
[0014] 当本发明所述的DNA分子W合适的取向和正确的阅读框插入到所述的载体或者 转入所述的宿主细胞中，所述的DNA分子可W在任何真核或者原核表达系统中表达。许多 宿主-载体系统都可W用来表达蛋白质编码序列。宿主-载体系统包括但不限于：用隧菌 体、质粒或粘粒转化的细菌；含有酵母载体的微生物，如酵母；用病毒感染的哺乳动物细胞 系统；用病毒感染的昆虫细胞系统；用细菌感染的植物细胞系统。本发明优选的载体包括 病毒载体、质粒、粘粒或者寡核巧酸。
[0015] 本发明优选的宿主为真核系统如毕赤酵母；本发明优选的蛋白质表达方法为毕赤 酵母甲醇诱导分泌表达。
[0016] 本发明人成功地获得了一种定点突变改造的酵母二肤基肤酶III，通过活性鉴定 实验，证明该二肤基肤酶III突变体具有野生型二肤基肤酶ΠΙ所不具备的氧化分解6-甲 氧基双巧喃香豆素的生物活性，且该生物活性达到了应用于饲料及其添加剂加工、食品及 其添加剂加工W及药物开发的程度。
[0017] 本发明的另一目的是提供将所述的定点突变改造的酵母二肤基肤酶III在制备 饲料及其添加剂或食品及其添加剂中消除6-甲氧基双巧喃香豆素的产品的应用。结合目 前的饲料和食品的加工工艺，可将本发明所述的定点突变改造的酵母二肤基肤酶III作为 脱毒剂添加到饲料中进行饲料脱毒，或者制成固定化酶用于如花生油等食品的脱毒，或制 成能够表达该酶的益生菌制剂或益生菌微囊等用于食品、粮油、饲料等的脱毒。
[0018] 本发明的另一目的是提供将所述的定点突变改造的酵母二肤基肤酶III在制备 预防由6-甲氧基双巧喃香豆素诱发的疾病的药物的应用。结合目前的常规药物制备工艺， 可用本发明所述的定点突变改造的酵母二肤基肤酶III制得到用于预防由6-甲氧基双巧 喃香豆素诱发的疾病（例如肿瘤）的药物。
【附图说明】
[0019] 图1为重组质粒myDPP表达质粒的鉴定图。
[0020] 图2为重组myDPP和重组wtyDPP的纯化结果。
【具体实施方式】
[0021] 本文中所采用的术语，除非另有说明，均为本领域技术人员所通常理解的含义。W 下提供在本发明中使用的一些特殊术语的定义。
[0022] "wtyDPP"表示野生型酵母二肤基肤酶III，其基因W斜体wtyDPP表示。 阳02引 "myDPP"表示突变体酵母二肤基肤酶III，其基因W斜体myDPP表示。
[0024]实施例1 :wtyDPP和myDPP的合成
[00巧]本发明WSaccharomyces cerevisiae S288c的二肤基肤酶基因（NCBI数 据库NM_001183312)序列作为参考，在5'端加入5' -GTCGAATTC-3'在3'端加入 3' -CCTAGGGAC-5' ' (GAATTC)为限制酶切位点EcoRI，(GGATCC)为限制酶切位点BamHI。采 用人工全合成的方法合成wtyDPP基因。
[0026]本发明WSaccharomycescerevisiaeS288c的二肤基肤酶基因（NM_001183312) 序列作为参考，将第570位的氨基酸用丙氨酸（Alanine,ALa,A)取代，第572位的氨基酸用 赖氨酸化ysine，Lys，K)取代，第574位的氨基酸用组氨酸化istidine，化s，H)取代，在5' 端加入 5'-GTC￡MII￡-3'在 3'端加入 3'-CCTAGGGAC-5'，(GAATTC)为限制酶切位点EcoRI， (GGATCC)为限制酶切位点BamHI。采用人工全合成的方法合成myDPP目的基因。 W27] 在定点突变改造后，第570位的丙氨酸（Alanine，ALa，A)、第572位的赖氨 酸化ysine,Lys，K)、第574位的组氨酸化iStidine,His,H)与第576位的谷氨酷 胺（Glutamine,Gin,曲、第578位的组氨酸化iStidine,His,Η)、第579位的甲硫氨 酸（Methionine,Met,Μ)、第580位的谷氨酷胺（Glutamine,Gin,曲、第581位的丙氨酸 (Alanine，ALa，A)W及第 582 位的精氨酸（Arginine，Arg，R)形成一个AXKXHXQXHMQAR(其 中，A为丙氨酸，R为精氨酸，X为任意氨基酸）序列。
[002引基因合成由商业性公司（例如上海捷瑞生物有限公司）完成。
[0029] 实施例2:重组质粒wtyDPP和myDPP表达质粒的构建
[0030]基因克隆按常规方法（Sambrook,etal. 2001,MolecularCloningAL油oratory Manual.ColdSpring化rborL油roratoiyPress.USA)进行，将实施例 1 所得的wtyDPP和 myDPP分别克隆到抑比-SI构建成表达质粒抑比-Sl-wtyDPP和表达质粒抑比-Sl-myDPP， 克隆后的目的基因经酶切、测序鉴定。
[0031] 具体做法：
[0032] 含myDPP的重组质粒抑比-S1的构建过程为：EcoRI+BamHI双酶切质粒抑比-S1 和目的片断myDPP，酶切产物进行0.8%琼脂糖凝胶电泳，并切胶回收。利用T4DNA连接酶 进行质粒抑比-S1和myDPP的连接。化CI2法制备E.coliD册α感受态细胞，转化D册曰 感受态细胞，筛选转化子，碱提质粒。用EcoRI+BamHI、化ndIII、SacI酶切鉴定重组质粒 pHlX-Sl-myDPP。挑取重组质粒阳G纯化法（Samb;rook，etal.2001，Molecula;rCloningA LaboratoryManual.ColdSpringHarborLabroratoryPress.USA)提取质粒DNA。WT7 和SP6为测序引物，采用DM自动序列仪，正反向进行测定。酶切结果如图1示，重组载体 pHIkSl-myDPP的酶切鉴定，BamHI、EcoRI双酶切（样品1)切下一条带位于2100bp左右， Hindlll单酶切（样品2)，SacI单酶切（样品3)。
[0033] 含wtyDPP的重组质粒抑比-S1的构建过程为：将含myDPP的重组质粒抑比-S1 的构建过程中的目的片断myDPP替换为wtyDPP，其他操作过程与含myDPP的重组质粒 pH比-S1的构建过程相同。
[0034] 实施例3 :重组myDPP和重组wtyDPP的表达
[0035] 重组myDPP的表达：用SacI酶切重组质粒抑比-Sl-myDPP和质粒抑比