一种猪伪狂犬病病毒基因缺失株、疫苗组合物及其制备方法和应用
【专利说明】-种猪伪狂犬病病毒基因缺失株、疫苗组合物及其制备方 法和应用
[0001] 本申请为专利申请201410059931. 9的分案申请
技术领域
[0002] 本发明设及一种猪伪狂犬病病毒基因缺失株、及其制备的疫苗组合物，W及制备 方法和应用，属于动物病毒学领域。
【背景技术】
[0003] 伪狂犬病，又称Aujeszky氏病，是由瘤疹病毒科化erpesviridae)α亚科中的猪 瘤疹病毒I型（Suidhe巧esvirusIstrain)所引起的猪、牛、羊等多种家畜、家禽和野生动 物的一种W发热、奇痒（除猪外）及脑脊髓炎为主症的急性传染病。猪的伪狂犬病在我国 广泛存在，危害严重，是制约规模化猪场生产的主要疫病之一。它能引起妊娠母猪流产、死 胎或木乃伊胎和仔猪出现神经症状、麻搏，死亡率高。PRV具有较强的泛嗜性、神经嗜性及潜 伏感染特性，在外周神经系统可W长期潜伏感染，当潜伏病毒被激活变成有感染力的病毒， 被潜伏感染的宿主就会发病。
[0004] 研究表明亚单位疫苗能够给免疫动物提供相应的保护，亚单位疫苗是利用基因工 程方法将病原保护性抗原基因克隆到原核或真核表达系统中，使其高效表达而制成的疫 苗。目前发现伪狂犬病毒糖蛋白中的浊、gC、曲均能使机体产生中和抗体，运些抗体无论是 在体内、体外，还是在有无补体存在的情况下都有中和PRV的能力。"伪狂犬病亚单位疫苗 研究进展"（杨承槐，类高明，湛南辉《江西畜牧兽医杂志》2004年第3期）公开了在伪狂犬 病病毒目前已发现的11种糖蛋白中，浊、gC、曲均能诱导机体产生中和抗体。在没有补体 的参与下，浊、gC、曲的单克隆抗体能中和PRV。猪和小鼠注射抗浊、gC、曲的单克隆抗体 均能抵抗PRV强毒的攻击。因此，浊、gC、曲是研制PRV亚单位疫苗的首选蛋白。糖蛋白曲 是一种重要的中和抗原，也是保护性抗体的主要目标，能诱导较好的保护反应。US6858385 和US6521231公开了利用猪伪狂犬病病毒曲蛋白可W制备疫苗用于猪伪狂犬病的预防。
[0005] 用于根除计划的疫苗的一个重要的因素是血清学标记，目前所有的PRV血清学检 测方法中，姐-ELISA是最有效的区分野毒株和疫苗株的方法。因此姐缺失疫苗有利于伪 狂犬的根除计划。在美国和欧共体等发达国家已经明确规定仅能使用伪狂犬姐基因缺失 疫苗。专利申请CN103305474A提供的猪伪狂犬的变异株灭活疫苗，由于其不能识别野毒株 和疫苗株感染，因此在生产实践中存在相当的局限。
【发明内容】
[0006]为解决现有技术的不足，本发明的主要目的是提供一种猪伪狂犬病病毒株，其中， 所述猪伪狂犬病病毒株具有编码序列表SEQIDNO. 1所示的氨基酸序列曲糖蛋白的核巧 酸序列，并且不含编码姐糖蛋白的核巧酸序列。
[0007]可选择地，所述猪伪狂犬病病毒具有SEQIDNO. 1的氨基酸序列或与其共有98% w上同源性的氨基酸序列表示的曲糖蛋白，且不含姐糖蛋白。
[0008] 可选择地，所述猪伪狂犬病病毒可包含具有SEQ ID NO. 2的氨基酸序列或其片段 共有95%W上核巧酸同源性的浊蛋白。
[0009] 可选择地，所述猪伪狂犬病病毒可包含具有SEQ ID NO. 3的氨基酸序列或其片段 共有95%W上核巧酸同源性的gC蛋白。
[0010] 本发明术语"曲糖蛋白"，是猪伪狂犬病病毒进行感染必需的结构蛋白，是成熟的 病毒粒子囊膜表面的主要糖蛋白之一，也称为甜50蛋白。
[0011] 本发明术语"同源性"在本申请中是指两条氨基酸序列或两条核巧酸序列的相 似程度。氨基酸序列或核巧酸序列的同源性可W通过本领域公知的任何适当的方法计 算得到，例如，可W将目标氨基酸（或核巧酸）序列与参比氨基酸（或核巧酸）序列进行 序列比对，必要时可W引入空缺，使得两条比对的序列间相同的氨基酸（或核巧酸）数目 达到最优化，并在此基础上计算两条氨基酸（或核巧酸）序列之间相同氨基酸（或核巧 酸）的百分比。氨基酸（或核巧酸）序列的比对和同源性的计算可W通过本领域公知的 软件实现，例如，但不限于，BLAST软件（在美国国立生物技术信息中屯、（NCBI)的网址上 可获得：ht1:p://blast, ncbi. nlm. nih. gov/Blast. cgi，或者见，例如，Altschul S. F. et al, J. Mol. Biol. , 215 :403-410 (1990) ；Stephen F. et al, Nucleic Acids Res. ,25： 3389-3402(1997))，ClustalW2软件（在欧洲生物信息研究所网址上可获得：http://丽w. eji. ac. uk/Toolsa/clustalw2/，另见，例女曰，Hi邑邑ins D. G. et al,Methods in Enzymolo邑y， 266:383-402(1996) ;Larkin M. A. et al，Bioinformatics (Oxford, England) ,23(21): 2947-8(2007));和TCoffee软件等（在瑞典生物信息学研究所的网站上可W获得： http://tcoffee.vital-it.ch/cgi-bin/Tcoffee/tcoffee_cgi/index.cgi，另见，例女曰，Poirot 0. et al,Nucleic Acids Res. ,31(13) :3503-6(2003) ；Notredame C. et al,J.Mol. Boil.，302 (1) :205-17 (2000))。使用软件进行序列比对时，可W使用软件提供的默认参数， 或者也可W根据实际情况对软件提供的参数进行调整，运些都在本领域技术人员的知识范 围内。
[0012] 本发明的另一目的是提供一种猪伪狂犬病病毒HN1201株的姐基因缺失株，其中， 所述HN1201株的姐基因缺失株不含编码姐糖蛋白的核巧酸序列。
[0013] 优选地，所述猪伪狂犬病病毒株为通过基因工程手段去掉姐基因HN1201株 (Pseudor油ies virus, strain HN1201)或其培养物，所述的猪伪狂犬病毒HN1201株 (Pseudor油ies virus strain HN1201)保藏号为CCTCC NO. V 201311;保藏于中国典型培 养物保藏中屯、；保藏地址为中国武汉?武汉大学，保藏日期为2013年5月20日。
[0014] 所述术语"培养物"是病毒的不同代次传代培养物，本领域技术人员知晓不同代次 之间其基因序列仅可能会发生微小的变异，优选地，所述培养物是5-35代W内的培养物。
[0015] 优选地，所述HN1201株的姐基因缺失株染色体姐基因部位核巧酸序列为编码序 列表SEQ ID NO. 10所示的氨基酸序列的核巧酸序列。
[0016] 本发明的再一目的是提供一种疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物包括免疫量的 所述的猪伪狂犬病病毒株姐基因缺失株或其培养物的减毒活的全病毒抗原、灭活全病毒 抗原、亚单位抗原。
[0017] 优选地，本发明的疫苗组合物包含所述猪伪狂犬病病毒或其抗原作为活性成分。 用于疫苗的组合物的猪伪狂犬病病毒具有SEQIDNO. 1的氨基酸序列或与其共有98%W上 同源性的氨基酸序列表示的曲糖蛋白，且不含姐糖蛋白。
[0018] 用于本发明的抗原是指病毒组分的抗原部分，它引起免疫应答，并可包含具有与 SEQIDNO. 1的氨基酸序列。
[0019] 可选择地，抗原可包含具有SEQIDNO. 2的氨基酸序列或其片段共有95%W上核 巧酸同源性的浊蛋白。
[0020] 可选择地，抗原可包含具有SEQIDNO. 3的氨基酸序列或其片段共有95%W上核 巧酸同源性的gC蛋白。
[002。 优选地，所述疫苗组合物包括>l06'°TCIDw/ml的所述的猪伪狂犬病病毒株姐基 因缺失株或其培养物的减毒活的全病毒抗原、灭活全病毒抗原。
[0022] 所用的术语"灭活疫苗"，也称作失活疫苗，指的是用作抗原W产生免疫力的灭活 病毒的混悬液。灭活疫苗的例子包括全病毒疫苗和裂解型疫苗。使用已知方法可W很容易 地产生灭活疫苗。例如，通过用甲醒溶液处理病毒可获得全病毒灭活疫苗。裂解型疫苗可 在用酸处理后由病毒包膜制备得到。
[0023] 优选地，本发明的疫苗组合物可包含每头份106'°TCI^。量的猪伪狂犬病病毒。当 猪伪狂犬病病毒W少于ι〇6·°τα^。的量使用时，疫苗不能有效刺激抗体产生。另一方面，超 过的量可能是不经济的。
[0024] 优选地，所述疫苗组合物包括> 25μg/ml的所述的猪伪狂犬病病毒株姐基因缺 失株或其培养物的曲蛋白抗原。
[0025] 此外，本发明的猪伪狂犬疫苗可与其他失活病原体或抗原组合使用W制备抵抗包 括猪伪狂犬病的各种疾病的联合疫苗或复合疫苗。本发明所用的术语"联合疫苗"用于指 从本发明的猪伪狂犬病病毒与至少一种不同病毒的病毒混合物制备的疫苗。术语"复合疫 苗"指的是从病毒和细菌制备的疫苗。
[0026] 优选地，所述疫苗组合物还包括介质、佐剂、赋形剂。
[0027] 本发明的疫苗组合物还可包含介质、佐剂和/或赋形剂。生理盐水或蒸馈水可用 作介质。用于疫苗组合物的佐剂的例子包括弗氏的不完全佐剂或完全佐剂、氨氧化侣凝胶、 植物油或矿物油等。赋形剂的例子包括憐酸侣、氨氧化侣和硫酸侣钟，但不限于此。在实践 中，本领域技术人员已知的用于疫苗制备的所有物质均可适用于本发明的疫苗组合物。
[0028] 本发明的又一目的是提供一种制备所述的疫苗组合物的方法，所述方法包括：（1) 培养增殖所述猪伪狂犬病病毒株姐基因缺失株或其培养物；(2)收获所述增殖的