一种人肺癌耐百草枯细胞株的利记博彩app
【技术领域】
[0001] 本发明属于细胞工程技术领域，设及一种人类细胞株，具体设及一种人肺癌耐百 草枯细胞株及其建立方法和应用。
【背景技术】
[0002] 百草枯（paraquat,P曲是一种全球广泛使用的高效能除草剂，其对人体具有很强 的毒性，经消化道、皮肤、呼吸道及静脉等吸收均可造成中毒，临床上缺乏有效的治疗措施， 患者死亡率高达40~80%。我国PQ的生产和用量均居全球首位。近年国内PQ中毒发病 呈倍数增长，防治形势非常严峻。尽管2015年6月我国开始推出逐渐禁止PQ水液的生产 与销售，但是其他剂型仍将继续生产与使用。因此，百草枯中毒仍是我国今后中毒防治的重 要任务。
[0003] PQ中毒可致全身多个脏器损伤，其中肺是受累最严重的祀器官，可出现"百草枯 肺"，即早期表现为急性肺损伤，而后期则进展为肺间质纤维化，是PQ中毒患者死亡的主要 原因。PQ在肺组织的主动摄取和蓄积被认为是持续诱导肺损伤造成患者呼吸衰竭的关键。 然而，迄今对百草枯，在肺细胞的跨膜转运及蓄积机制研究一直没有突破，也没有找到相应 的干预措施，已成为百草枯解毒研究中的关键问题。
[0004] 近年，有研究通过对耐PQ的突变植株（牛筋草、拟南芥等）相关耐药机制的分析， 阐述了PQ在植物内转运相关的重要信息。运为研究人体PQ毒理及其跨膜转运机制提供了 新思路。通过构建耐百草枯的人体细胞株，并进一步研究其括抗百草枯毒性机制机理，有望 发现逆转百草枯毒性的新途径。
[0005] 迄今，未见有W百草枯诱导建立哺乳动物耐药细胞株的方法报道。目前肿瘤耐药 细胞株的建立通常有两种方法，一是逐步增加药物浓度、持续诱导法，二是大剂量冲击间断 给药法。一般认为，浓度递增连续诱导的方法是通过药物持续作用，使肿瘤细胞生理和遗 传特性发生改变W逐渐适应药物的毒性，属于获得性耐药。目前国内外尚无对百草枯耐药 的哺乳动物细胞株，通过耐百草枯细胞株的建立，可W用于百草枯中毒防治研究提供了重 要的基础研究模型。通过检索发现，目前国内外还没有关于W人肺癌细胞株A549为诱导对 象，建立人肺癌耐药百草枯细胞株的文献报道。
【发明内容】
[0006] 鉴于现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种人肺癌耐药百草枯细胞株及其 建立方法，可W用于百草枯毒理机制、跨膜转运研究及发掘逆转百草枯毒性途径、研发百草 枯中毒治疗药物等提供细胞模型。
[0007] 本发明的人肺癌耐百草枯细胞株A549/PQ，已于2015年06月16日在中国微生物 菌种保藏管理委员会普通微生物中屯、，其简称为CGMCC(地址：北京市朝阳区北辰西路1号 院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101)保藏，分类命名为人肺癌细胞，保藏编号为 CGMCCNo. 10892。
[0008] 本发明采用的技术方案是：
[0009] 本发明A549/PQ耐药细胞株的按W下步骤建立，采用人肺癌细胞株A549为诱导对 象，改良连续诱导法，即采用浓度递增、周期暴露的方法进行PQ暴露建立了人肺癌耐百草 枯细胞株A549/PQ。该细胞株已经于2015年06月16日在中国微生物菌种保藏管理委员会 普通微生物中屯、保藏，保藏号为CGMCCNo. 10892。
[0010] 具体地，本发明设及的人肺癌耐百草枯细胞株A549/PQ是按照如下方法建立获 得：
[0011] (1)人肺癌细胞株4549细胞置于培养液（含10%胎牛血清的1?^1-1640培养基）， 37°C，5%C〇2条件下常规培养。
[0012] (2)取步骤（1)对数生长期的细胞用于实验，采用浓度递增、周期暴露的PQ诱导 法建立细胞耐药株，PQ在培养基中的浓度首先从100μmol/L开始，加药24h后换液去除药 物，待细胞重新生长至对数期后再次加入相同浓度PQ刺激，如此重复3次，然后延长暴露时 间至4她（即100μmol/L的PQ暴露4她），换液，除去药物，待细胞重新生长至对数期后，再 次给予相同药物相同时间的暴露，如次重复3次。随后再增加PQ浓度，每个浓度下诱导的 方案一致，递增PQ浓度梯度依次为100、200、400、600、800μmol/^，连续培养ll个月，获得 A549耐PQ细胞株，人肺癌耐百草枯细胞株A549/PQ。
[0013] 本发明具有W下优点及效果：
[0014] 光学显微镜观察细胞形态学变化、流式细胞术检测细胞周期分布、CCK-8法及LDH 释放实验检测细胞生长曲线及对百草枯耐药性、高效液相色谱分析OffLC)法检测细胞内 PQ浓度等，我们发现，与亲本细胞比，人肺癌耐百草枯细胞株A549/PQ细胞体积增大、形态 不规则、细胞间隙小；细胞的倍增时间明显延长；细胞周期分析表明耐药组G0/G1期细胞明 显增多，而S期细胞明显减少；CCK-8检测表明PQ暴露后人肺癌耐百草枯细胞株A549/PQ存 活率明显高于亲本细胞，其对PQ的耐药指数7. 98,为中度耐药；LDH释放实验也证实PQ诱 导的人肺癌耐百草枯细胞株A549/PQ细胞损伤明显轻于亲本细胞；流式细胞检测表明PQ诱 导的人肺癌耐百草枯细胞株A549/PQ细胞早期调亡率低于亲本细胞；HPLC法测得暴露后人 肺癌细胞株A549/PQ细胞内PQ浓度明显低于亲本细胞。表明人肺癌耐百草枯细胞株A549/ PQ细胞与亲本细胞间存在明显的生物学差异，且细胞内浓度降低预示耐药细胞可能存在括 抗PQ蓄积的机制。
[0015] 本发明在浓度递增持续诱导法基础上，进一步进行改良，采用浓度递增、周期暴露 PQ诱导人肺癌细胞A549,即充分考虑浓度逐渐递增的同时，又在同一浓度下采用逐渐延长 暴露时间的方法，为A549细胞激活相关代偿途径提供缓冲时间，有利于细胞逐渐地适应PQ 的毒性，从而获得对PQ的耐药性，提高诱导成功率。通过该方法，本发明首次获得对PQ耐 药的人肺癌A549细胞（A549/PQ)，该细胞株具有明显的抗PQ毒性特性，为进一步研究应用 逆转PQ毒性途径、提取百草枯中毒评价标志物、发掘抗氧化新途径等提供了良好的研究应 用模型。
【附图说明】
[0016] 图1为光镜下人肺癌细胞株A549和人肺癌耐百草枯细胞株A549/PQ的显微图
[0017]A:A549 细胞；B:A549/PQ细胞
[0018] 图2为人肺癌耐百草枯细胞株A549/PQ及人肺癌细胞株A549细胞生长曲线图。
[0019] 图3为人肺癌耐百草枯细胞株A549/PQ及人肺癌细胞株A549细胞倍增时间图。
[0020] 图4为PQ诱导人肺癌耐百草枯细胞株A549/PQ和人肺癌细胞株A549细胞死亡率 的比较图。
[0021]a:与400ymol/LPQ诱导A549组死亡率比P<0. 05;b:与800ymol/LPQ诱导 A549组死亡率比P<0. 05
[0022] 图5为PQ暴露后人肺癌耐百草枯细胞株A549/PQ和人肺癌细胞株A549细胞生存 率曲线图。图6为PQ诱导人肺癌耐百草枯细胞株A549/PQ和人肺癌细胞株A549细胞IC50 的比较图。
[0023]曰：与八549组比？<0.05
[0024] 图7为PQ诱导人肺癌耐百草枯细胞株A549/PQ和人肺癌细胞株A549细胞内PQ 浓度的比较图。 阳0巧]A:为标注品PQ检测的HPLC色谱图；B:检测标本PQ检测的HPLC色谱图；C:LDH释 放实验检测PQ诱导细胞死亡率的比较；D:HPLC检测细胞内PQ浓度的比较；黑色箭头：PQ 出峰时间化.70min)。* :表示相同浓度PQ暴露下两组间比较P< 0. 05 :表示相同浓度 PQ暴露下两组间比较P< 0. 05
【具体实施方式】
[00%] 下面通过实施例进一步说明本发明。本发明的实施例仅仅是用于说明本发明，而 不是对本发明的限制，在本发明的构思前提下对本发明方法的简单改进都属于本发明要求 保护的范围。
[0027] 实施例1人肺癌耐百草枯细胞株的诱导建立
[0028] 人肺癌耐百草枯细胞株4549作9按^下步骤建立：（1)4549细胞置于含10%胎牛 血清的1640培养基中常规培养，条件为37°C，5%C〇2。每次取对数生长期的细胞用于实 验。（2)采用浓度递增、周期暴露的PQ诱导法建立细胞耐药株：PQ在培养基中的浓度首先 从100μmol/L开始，加药24h后换液去除药物，待细胞重新生长至对数期后再次加入相同 浓度PQ刺激，如此重复3次。然后延长暴露时间至4她（即100μmol/L暴露4她），换液除 去药物，待细胞重新生长至对数期后，再次给予相同药物相同时间的暴露，如次重复3次。