用于人细胞分离的小鼠细胞排除的利记博彩app
【专利说明】用于人细胞分离的小鼠细胞排除
[0001]发明背景
本发明涉及在异种移植时用于人细胞的种属分离的小鼠细胞的排除。
[0002]人肿瘤异种移植物代表着如药物发现、癌干细胞生物学和转移预测等研究领域的黄金标准方法。异种移植物可从原发性人肿瘤材料、连续移植的肿瘤组织或培养细胞衍生。当与体外细胞培养模型相比时，人肿瘤异种移植物显示对大部分测定更高的有效性(Rub1-Viqueira B和 Hidalgo, Μ.(2009) Clin.Pharmacol.Ther.85: 217-221)。除了在癌症研究中的应用外，人细胞至小鼠中的异种移植还经常在干细胞研究中使用以确定目标群体的分化潜能。
[0003]在体内生长期期间，异种移植的组织血管化并被小鼠起源的细胞，包括异种淋巴细胞亚群、成纤维细胞和内皮细胞浸润。浸润水平高度取决于肿瘤亚型、生长速率和移植区域等因素。然而，即使当这些因素保持不变时，浸润小鼠细胞的量和组成也非常多变，这使得精确的分子下游分析困难。污染的小鼠细胞导致小鼠-衍生的分子与微列阵上的人探针交叉-杂交和/或在下一代测序或蛋白质组分析期间由小鼠信号被测量所导致的灵敏度显著降低(Wong, S.Q.等.(2013) Sc1.Rep.3: 3494)。
[0004]此外，人肿瘤细胞培养物常常被长满靶细胞的鼠类成纤维细胞妨碍。为了从期需的人异种移植物分离小鼠细胞或小鼠细胞碎片，已经尝试了排除小鼠细胞或通过软件增强分析过程。
[0005]为了在异种移植后排除小鼠细胞，C.C.Zhang等在Stem Cells Transl.Med.2:233-242 (2013)中提出了识别小鼠⑶45和MHC I型表位的抗体的组合。
[0006]S.B.WILLINGHAM等在PROCEEDINGS OF THE NAT1NAL ACADEMY OF SCIENCES (国家科学院院刊)，“The CD47_signal regulatory protein alpha (SIRPa) interact1n isa therapeutic target for human solid tumors (CD47-信号调节蛋白 a (SIRPa)相互作用为人实体瘤的一个治疗靶标)”，第109卷，17期，2012年3月26日，第6662-6667页公开了使用靶向人表位的抗体来富集被小鼠细胞污染的人细胞。小鼠细胞的排除未公开。
[0007]现有技术中已经提出了识别小鼠细胞的抗体的进一步组合，例如W0 2009/045201A1公开了经由鼠类表位CD45、CD31和H-2Kbd排除小鼠细胞。相似地，W0 2008/115601 A1描述了用于排除小鼠细胞的小鼠MHC I抗体。在W0 2012/010904 A1中，公开了小鼠谱系特异性的微珠。
[0008]然而，使用这些标志组合，仅能检测小鼠细胞的亚类。
[0009]此外，来自异种移植物的人肿瘤细胞培养物常常被小鼠成纤维细胞妨碍，这是因为成纤维细胞更有效地贴附和扩展，因此长满在靶细胞上。即使当靶细胞贴附和生长良好时，体外细胞培养测定(例如药物细胞毒性试验或药代动力学)仍成问题，这是因为在大多数情况下对源于污染小鼠细胞的效应的数学校正是不可能的。
[0010]另一从异种移植物分离人细胞的策略为将仅在人细胞上表达而不在鼠细胞上表达的标志物用于从异种移植物排除人细胞。因此分离的人细胞与标志物结合，这可能妨碍进一步的纯化/选择步骤。
[0011]发明概述
本发明的一个目标在于提供从宿主细胞特别是从鼠类细胞排除未受影响的人异种移植物的方法。
[0012]意想不到地，CD9经鉴定为允许在包含鼠类和人细胞的混合物中检测和排除鼠细胞的合适表位。
[0013]因此本发明的目标为从人细胞在鼠类宿主上的异种移植物中排除宿主细胞的方法，其特征在于
a)将异种移植物破碎成包含单细胞悬液的样品；
b)使样品经受偶联检测手段的鼠类CD9表位特异性抗体；
c)使用检测手段从CD9-抗体结合的细胞排除样品；
d)收集不被CD9-抗体结合的细胞作为靶细胞。
[0014]用本发明方法获得的靶细胞为优选的基本“未受影响的”，即没有或基本上没有与任何抗体偶联。
[0015]然而，排除宿主细胞后所获得的细胞可与抗体偶联用于进一步纯化。
[0016]来自鼠类宿主的绝大多数细胞类型被⑶9抗体识别并且可用本发明方法从靶细胞排除。鼠类细胞可为从大鼠或小鼠可获得的任何细胞。这包括横跨多个器官，例如皮肤、肺、脑、肾和骨骼肌(所有这些均代表用于异种移植的靶组织)的鼠类细胞。
[0017]本发明方法可用于分离所有类型的人细胞，特别是人肿瘤细胞，例如，人乳腺癌细胞、人结肠癌细胞、人肺癌细胞、人前列腺癌细胞、人胰腺癌细胞、人黑色素瘤癌细胞、人白血病癌细胞和人淋巴瘤癌细胞。
[0018]当使用细胞表面表位用于筛查时关键点在于将温和的程序和纯酶用于组织分裂以避免靶分子降解。因此，在本方法的第一个步骤中，通过组织的机械破坏(借助或不借助酶)将异种移植物破碎或分解成基本上单细胞的悬液。
[0019]附图简述
参照下列附图描述了各种例示性的细节，其中:
图1显示通过识别鼠类⑶45和MHC I表位的方法，仅可检测小鼠细胞的亚类；
图2显示⑶9为鼠类细胞上一个广泛表达的表位；
图3显示本发明抗体混合剂用于在一个细胞级分中消除小鼠细胞的效率；
图4显示⑶9经鉴定为小鼠肺细胞上的表位甚至在肺组织上与MHC I型和⑶45组合相比更广泛表达；
图5显示⑶9在小鼠皮肤细胞上比MHC更广泛表达，甚至与MHC I型和⑶45组合相比更广泛表达；和
图6A显示通过将⑶45/MHC I和⑶9用于排除来排除小鼠细胞从小鼠脑分离人成胶质细胞瘤细胞；图6B显示紧接着排除能存活的小鼠细胞后，用CD9-抗体，可将死细胞和碎片从样品去除，当将CD45/MHC用于排除时未观察到此种效果。
[0020]发明详述
术语“基本上单细胞”意指将组织分解为分离的单细胞。以完全自动化的方式分离或破碎通过例如使用从Miltenyi B1tec GmbH可获得的具有加热器的gentleMACS ? OctoDissociator和相应的组织分离试剂盒(如人肿瘤分离试剂盒，其对表位保存进行了优化)而有可能。
[0021]根据期需的靶细胞纯度，可通过加入另外的抗体去除小部分的宿主细胞，即使对于那些的大部分而言表达模式与⑶9重叠。
[0022]在本发明另一个实施方案中，使步骤a)或步骤b)或步骤c)的至少一个中所获得的细胞悬液/样品进一步经受对鼠类⑶9表位特异的抗体和对选自⑶45、⑶51、⑶31、⑶24、EpCAM、Seal、CD81、CD44、CDllb、CD95、H2Kk、H2Kd、CD171、CD90.1、CD90.2 和 Terll9 的一种或多种鼠类表位特异的抗体(每种偶联一种检测手段)。在该实施方案中，异种移植物/细胞悬液从与鼠类CD9抗体偶联的细胞和从与这些抗体偶联的细胞排除。
[0023]优选使用包含对鼠类表位⑶9、⑶45、⑶51、⑶31和Terll9特异的抗体的抗体混合剂，这在本方法步骤b)中给予。
[0024]对于本发明方法中所使用的全部抗体而言检测手段可相同或不同。合适的检测手段可选自磁性颗粒、荧光染料或固体载体。
[0025]磁性颗粒在本领域已知为超顺磁纳米颗粒(Micro Beads)，其可从MiltenyiB1tec GmbH获得。合适的荧光染料为例如FITC、PE、APC荧光染料或串联染料。固体载体可为塑料平皿或瓶以及柱或微流体元件。当然，抗体可携带一种或多种检测手段。
[0026]步骤c)的排除按照检测手段所需进行，所述检测手段例如磁性分离、淘洗或FACS。
[0027]现有技术建议从异种移植物分离某些人肿瘤亚群，例如癌干细胞(CSC)。然而，在一个亚群从人细胞级分分离出后，小鼠细胞仍然污染阴性级分，这导致有偏倚的全部主要类型的下游分析结果。在分析靶细胞的功能和分子特征(例如通过基于微列阵的表达图谱或下一代测序)之前，获得非常纯的靶细胞样品是先决条件。
[0028]为防止此缺点发生，可使用本发明方法产生无污染性鼠类宿主细胞的人细胞群。在本发明进一步的实施方案中，在步骤e)中，使步骤d)中所获得的靶细胞经受与检测手段偶联的人标志物特异性抗体并使用检测手段进一步分为至少两个包含不同细胞亚群的级分。