一株高产天冬氨酸脱羧酶的菌株及用于生产丙氨酸的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，特别设及一株生产k天冬氨酸α-脱簇酶的菌株，W 及利用该菌株生产的心天冬氨酸α-脱簇酶发酵液催化制备β-丙氨酸的方法。
【背景技术】
[0002] β-丙氨酸是天然存在的唯一β型非蛋白氨基酸，用于合成肌肤、泛酸巧、己柳氮 及帕米憐酸钢等医药产品，用途非常广泛。目前β-丙氨酸主要采用化学合成法，成本高、 条件及生产环境不友好等缺点，开发绿色安全的生物法生产工艺将具有十分明显的经济和 社会效益。心天冬氨酸α-脱簇酶（X-aspartatea-decarbo巧lase，EC4. 1. 1. 11，PanD) 是泛酸生物合成途径中的关键酶，催化k天冬氨酸脱簇基生成β-丙氨酸，利用该酶W廉 价的k天冬氨酸为原料可W实现β-丙氨酸绿色高效的工业生产。
[0003] PanD在大肠杆菌巧scherichiacoli)、结核分枝杆菌（Mycobacterium 1:ube;r州losis)、沙口氏菌（Salmonellatyphimurium)、谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutami州m)及幽口螺杆菌化elicobacterp^ori)等微生物中均有存在，目前研究较多 的是大肠杆菌和结核分枝杆菌。国内外研究者利用上述菌株做了很多研究工作，如美国 NSC技术有限公司扩增表达了E.coli来源的PanD基因，测得该酶酶活为0. 115mmol/g'h， Qiopra等人扩增了致病菌Mycobacterium1:ube;r州losis来源的PanD基因并在E.coli BL21(DE3)中表达，粗酶液酶活达到0. 035mmol/g·]!，高丽娟等将E.coliD册α来源的panD 在E.coliBL2UDE3)中表达构建工程菌，酶活为224. 96U/L;洪敏等将E.coliD册apanD 连接到祀T28c(+)载体，转化E.coli化21 0E3)，经诱导培养重组菌酶活为18抓/L发酵 液。W上报道受限于较低的酶活力，距离工业化应用尚有较大的距离。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供从葡萄园中分离得到的一株高效生产k天冬氨酸α-脱簇 酶的菌株，并应用该菌株产生的心天冬氨酸α-脱簇酶酶法制备β-丙氨酸的方法。 阳0化]本发明所提供的产心天冬氨酸α-脱簇酶的菌株是从烟台地区葡萄园上壤中 分离得到，运是一株k天冬氨酸α-脱簇酶分泌能力极高的菌株，培养方法简单，生长速 度快，不易变异，可W直接用于酶法制备β-丙氨酸。将其编号为PanD37,保藏于中国普 通微生物菌种保藏管理中屯、，保藏日期为2015年2月2日，分类命名为特基拉芽抱杆菌 PanD37(BacillustequilensisPanD37)，保藏编号为：CGMCCNo. 10506。该菌株的 16S rDNA基因序列已递交到了GenBank数据库，获得登录号KP635214。在ht化://www.ncbi. nlm.nih.gov/网站上用blast程序与已登录细菌菌株的16SrDNA基因序列进行比较，结果 表明菌株PanD37与Bacillustequilensis相似度最高，达到99%。
[0006] 本发明所述菌株的k天冬氨酸α-脱簇酶的发酵生产及用于催化制备β-丙氨 酸的方法如下：
[0007] 1、培养基配制
[0008] (1)固体保藏培养基：酵母浸粉5g/L，蛋白腺lOg/L^C1 5g/L琼脂20g/LpH 7. 0,12rC高压蒸汽灭菌20min;(2)液体种子培养基：酵母浸粉1~lOg/l，蛋白腺5~ lOg/L，化C1 1~5g/L，抑7. 0,121°C高压蒸汽灭菌20min;(3)发酵培养基：葡萄糖10~ 30邑/1，蛋白腺5~20g/l，天冬氨酸1~lOg/l，1拆〇4〇. 1~0. 5g/l，硫酸锭2~15g/l， KH2PO4O. 1 ~Ig/L，pH7. 0,115°C高压蒸汽灭菌 20min。
[0009] 2、菌株活化：挑取菌种划线接种至固体保藏培养基，于恒溫培养箱30°C培养14~ 20h;
[0010] 3、液体种子制备：挑取活化菌株接种于装有种子培养基的Ξ角瓶中，纱布封口，于 25~37°C，160~20化/min摇床振荡培养12~2地，得液体种子；
[0011] 4、液体发酵：按5~10%接种量向发酵培养基接入液体种子，转速200~70化/ min,溶氧控制20~50%，pH7. 0~7. 5,溫度25~37°C，通气培养24~4她，得到k天冬 氨酸α-脱簇酶的发酵液；
[0012] 5、催化制备β-丙氨酸：将心天冬氨酸α-脱簇酶的发酵液置于转化罐中，每 100血发酵液投放k天冬氨酸1~3g，用盐酸调抑至6.0~8.0,溫度35~45°C，敞口散 气，维持转速在50~l(K)r/min，反应5~lOh。
[0013] 本发明与现有技术相比的有益效果：
[0014] 1、本发明提供的特基拉芽抱杆菌PanD37,不同于W往的心天冬氨酸α-脱簇酶产 生菌种，尚未有该菌株产心天冬氨酸α-脱簇酶的报道，进一步拓宽了β-丙氨酸生产的 菌种渠道；
[0015] 2、本发明所提供的特基拉芽抱杆菌PanD37遗传稳定性好，培养基成分简单原 料成本低，产生的k天冬氨酸α-脱簇酶酶活力高，可直接利用该菌株发酵液直接转化 0-丙氨酸，工业应用具有优势。
[0016] 3^-天冬氨酸α-脱簇酶可W自然渗透细胞外，催化合成β-丙氨酸时无需加入 表面活性剂、有机溶剂等透膜剂，避免引入外源杂质，有利于提取分离操作。
【具体实施方式】
[0017] 为阐明对本项发明特征的理解，下面结合一些非限定性的实施实例对本发明做进 一步阐述。
[0018] 实施例1:特基拉芽抱杆菌菌株分类
[0019] 1)菌种特性
[0020] 在保藏培养基上菌落呈乳白色、近圆形、表面干燥、不透明、有權皱、无光泽、边缘 不规则成裂叶状、易挑取；通过显微镜观察，菌体呈杆状，单个不成链，革兰氏阳性，培养 4化后观察芽抱着生在菌体侧端位置或游离存在，不膨大，楠圆形或柱形。
[0021] 2)菌株鉴定
[0022] 经DNA提取、PCR扩增和测序获得的16SrDNA基因序列长度为1459bp，在GenBank 上进行BLAST比对，得出该菌株与特基拉芽抱杆菌Bacillustequilensis(JX412373)碱基 相似性达99%，序列信息如下：
[0023] tggctttgcgcttgctatacatgcaagtcgagcggacagatgggagcttgctccctgatgttagcggcg g过Cgggtg过gt过过C过cgtgggt过过cctgcctgt过过g过ctggg过t过过ctccggg过过过ccggggct过过t过ccgg过tggt
[0024]如菌种保藏
[00巧]本项发明所述的特基拉芽抱杆菌PanD37(BacillustequilensisPanD37)，已于 2015年2月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中屯、，保藏编号：CGMCC No. 10506,保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
[0026] 实施例2
[0027] 1)菌株活化：挑取菌种至固体保藏培养基：酵母浸粉5g/l，蛋白腺lOg/l，^C1 5g/L，琼脂20g/L，抑7. 0,划线接种于恒溫培养箱30°C培养20h;
[0028] 2)液体