青海弧菌q67b及其分离筛选和应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及青海弧菌Q67B及其分离筛选和应用，属微生物学的发光细菌分离筛 选和应用的技术领域。青海弧菌Q67B是淡水发光菌。从青海省青海湖所产的青海避鱼体 表采集淡水发光菌，经分离、纯化、筛选后，得到一种新的淡水发光菌种菌株，leSrDNA序列 分析表明，该菌属弧菌属，定名为"青海弧菌Q67B(Vibrioqin曲aiensisQ67B)"。2010年 1月28日将其送交武汉市中国典型培养物保藏中屯、（CCTCC)保藏，保藏编号为CCTCCNO: M2010104,保藏中屯、地址为：中国武汉市武汉大学典型培养物保藏中屯、，邮编：430072。
【背景技术】
[0002] 发光菌是一大类能自身发出巧光的细菌，在条件合适时，其发光恒定。若发光菌接 触到有毒有害物质时，其发光就会受抑制，抑制程度与所接触的毒物的毒性大小和毒物的 浓度有关。因此发光菌可用于检测样品的生物学毒性。上世纪八十年代，发光菌就己被用 于环境污染的检测。我国也于1995年发布了将发光菌用于水环境污染的毒性检测的国家 标准。但不管国际还是国内，均使用来源于海洋的海洋发光菌，该发光菌适应海洋的高盐度 (相当于化C1的质量百分浓度为3% )和高渗透压的环境条件，否则无法生长，更不会发 光。当用于陆地淡水样品时，必须在淡水样品中添加化C1，直至淡水样品中化C1的最终质 量百分浓度为3 %，否则淡水样品中的海洋发光菌很快就丧失发光能力，甚至细菌的细胞因 低渗透压而吸水破裂，无法继续进行检测。上世纪九十年代，随着发光菌应用于环境污染的 毒性检测日益增多，许多研究者发现，对有些种类的淡水样品，其检测结果往往与其它生物 检测结果不太吻合，尤其是那些含有重金属盐的样品。究其原因，乃对淡水样品添加化C1 所致。所W有研究者改用葡萄糖取代化C1来调节渗透压，使之与质量百分浓度为3%的 化C1溶液等渗，但效果并不理想，检测结果的重复性较差。运是因为海洋发光菌必需要有一 定浓度的化离子存在时才能保持良好而稳定的发光性能，缺乏化离子的环境对海洋发光 菌的发光是不利的，必然影响到海洋发光菌发光的稳定性，最终导致检测结果的严重偏差。 如果使用不需要化离子并适应较低的渗透压就能正常发光的淡水发光菌作为检测用发光 细菌，对淡水样品就不必添加化C1，避免了应用海洋发光菌作为检测用发光细菌的不足。
【发明内容】
[0003] 本发明的一个目的是公开一种青海弧菌Q67B，其特征在于，
[0004] (1)形态特征：该菌的菌体呈杆状微弯，大小介于0. 5~0. 7微米X1. 5~2微米， 革兰氏染色阴性，用利夫生鞭毛染色，观察到单极生鞭毛似峨料状，细胞内累积聚β-径基 下酸；
[0005] (2)生理生化特征：该菌适于生长的溫度范围和抑范围分别为4°C~40°C和 P册~抑10,对弧菌抑制剂2,4-二氨基-6, 7-二异丙基噪晚敏感，具有耐盐、耐高渗透压和 低渗透压的能力，能在介于质量百分浓度0%~8%之间的化C1溶液中生长和发光；
[0006] (3)基因特征：16SrDNA序列：
[0008] 所述的青海弧菌Q67B的进一步特征在于，该菌最适于生长的溫度和抑值分别为 25°C和抑 9.0。
[0009] 本发明的另一个目的是推出一种分离筛选青海弧菌Q67B的方法。为实现上述目 的，本发明采用W下的技术方案，其特征在于，该菌经过四个步骤，筛选得到：第一步获取淡 水发光菌，从青海省青海湖所产的青海避鱼体表采集到的发光菌，经分离纯化，获得淡水发 光菌；第二步溫度适应性筛选，在两个不同的溫度下对第一步获得的淡水发光菌进行溫度 适应性筛选；第Ξ步pH值适应性筛选，在两个不同的pH值下对第二步获得的淡水发光菌进 行抑值适应性筛选；第四步毒物反应灵敏性筛选，用重金属盐和有机毒物对第Ξ步获得的 淡水发光菌先后进行两次毒物反应灵敏性筛选。
[0010] 所述的分离筛选青海弧菌Q67B的方法的进一步特征在于，所述的两个不同的溫 度是4°C和40°C。
[0011] 所述的分离筛选青海弧菌Q67B的方法的进一步特征在于，所述的两个不同的抑 值是抑5.0和抑11.0。
[0012] 所述的分离筛选青海弧菌Q67B的方法的进一步特征在于，所述的重金属盐和有 机毒物分别是化C12和苯酪。
[0013] 青海弧菌Q67B具有宽的生长和发光的溫度范围：4°C~40°C;具有宽的生长和发 光的抑值范围：P册.0~抑11. 0 ;具有耐盐、耐高渗透压和低渗透压的能力，能在介于质量 百分浓度0%~8%之间的化C1溶液中生长和发光；对毒物的毒性反应灵敏，特别适合用于 陆地淡水样品或固体样品的水相抽提物的生物毒性快速检测和淡水样品的生物毒性快速 筛选。
[0014] 现结合附图详细说明本发明的技术方案。一种分离筛选青海弧菌Q67B的方法，其 特征在于，具体操作步骤：
[0015] 第一步获取淡水发光菌
[0016] (1)取新鲜的青海省青海湖所产的青海避鱼，截成小段，室溫下放置10小时~24 小时，在暗室内检视，在发绿色巧光的亮点处，用灭菌的接种针括取，划线于培养皿内，
[0017] (2)将第一步（1)所述的培养皿置于暗室中，20°C培养10小时~18小时，从中挑 取发光良好的单菌落，
[0018] (3)对第一步（2)所述的单菌落进行划线分离培养Ξ~五次，取得单细胞纯培养 物，转接于斜面试管，培养生长后得斜面菌种，即淡水发光菌，保存于4°C冰箱备用，
[0019] (4)所述的培养皿和斜面试管内需用固体培养基，该固体培养基的配方为，Μ拆〇4 2. 47g，MgC〇3 0. 79g，Μ浊。0. 〇9g，MgClz0. 109g，CaC〇3 0. 103g，KC1 0. 122g，化C1 8. 29邑， Mg化C〇3)20. 50g，酵母膏5g，膜腺5g，甘油3g，琼脂20g，溶于1000血蒸馈水中，pH9. 0， 12rC灭菌20分钟，胆于4°C的冰箱备用；
[0020] 第二步溫度适应性筛选
[0021] (1)将第一步（3)所得的斜面菌种，转接于五~十支斜面试管，
[002引似将第二步（1)所述的斜面试管置于暗室中，20°C培养16小时~18小时，检查 发光状况，选出发光良好的菌支，
[0023] (3)将第二步（2)选出的菌支分别转接于五~十支斜面试管，
[0024] (4)将第二步做所述的试管置于暗室中，20°C培养16小时~18小时，检查发光 状况，选出发光良好的菌支，
[00巧](5)将第二步（4)选出的菌支分别划线转接于十个平皿，平分成两组，为第I组和 第II组，分别于4°C和40°C培养16小时~18小时，
[0026] (6)另取十个平皿，平分成两组，为第III组和第IV组，每组五个平皿，暗室中挑取第 I组的每一个平皿中发光良好的一个单菌落分别划线转接于第III组的五个平皿，暗室中挑 取第II组的每一个平皿中发光良好的一个单菌落分别划线转接于第IV组的五个平皿，将第 III组和第IV组分别于40°C和4°C培养16小时~18小时，
[0027] (7)另取十支斜面试管，分别对应上述第III组和第IV组的每个平皿，将各平皿中发 光良好的一个单菌落分别划线转接于十支对应斜面试管中，20°C培养16小时~18小时，
[0028] (8)另取五支斜面试管，选取第二步（7)所述的十支斜面试管中发光良好的五个 斜面，分别转接到五支斜面试管中，得到五支斜面菌种，保存于4°C冰箱内备用，
[0029] (9)所述的斜面试管和平皿内需用固体培养基，该固体培养基与上述的第一步需 用的固体培养基完全相同，
[0030] (10)经第二步溫度适应性筛选操作后所得的菌种，具有耐低溫4°C和耐高溫40°C 的性能；
[0031] 第Ξ步抑值适应性筛选
[0032] (1)取第二步的做所得的斜面菌种，分别转接于抑5. 0和抑11. 0的液体培养基 中，各为五瓶，20°C振荡培养16小时~18小时，
[0033] (2)在经第Ξ步（1)操作后的抑5. 0和抑11. 0液体培养物中，各选取其中发光良 好的培养物，进行交换转接，即将抑5. 0液体培养基中选中的菌