一种卡介菌多糖及其制备与分析鉴定方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物制药领域，具体涉及一种卡介菌多糖及其制备与结构表征方法。 技术背景
[0002]多糖作为生命活动的物质基础之一包含丰富的生物信息，其来源广泛，结构组成 复杂且差异大，具有多样的生物活性，在生命科学研究中有极其重要的作用及应用前景。研 究表明多糖类及其衍生物，如许多植物和真菌多糖在免疫调节，抗肿瘤，抗凝，降血脂等方 面都具有显著的药理活性，近年来受到国内研究者的青睐，但有关细菌多糖的研究还比较 少。
[0003]卡介菌多糖核酸（Polysaccharide nucleic acid fraction of Bacillus Calmette Guerin, BCG-PSN)是我国首创的新型治疗和免疫调节剂，其中多糖占70% W上， 核酸占20% W上，临床上用于免疫调节、抗炎，抗过敏、抗肿瘤及辅助用药。但是BCG-PSN组 成成分的复杂性，药物作用的选择性降低，不良反应增多；有效成分不明确，给药物质量控 制研究，新型制剂开发，构效关系及作用机制阐释造成了一定的困难，进而制约了卡介菌类 药物的优化创新，影响了其药用价值和在同类药物中的市场竞争力。关于卡介菌多糖的结 构研究，国内外报道未见，送对阐释卡介菌多糖的构效关系和作用机制带来了挑战。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种卡介菌多糖及其制备方法，并且对得到的高纯度多糖化 学结构进行了鉴定阐释，明确其有效成分，为优化现有卡介菌多糖核酸药物、质量控制及深 入研究其构效关系和作用机制奠定基础。具体方法和步骤如下：
[0005] -种卡介菌多糖，分子量为1. 78X104Da，W(1 - 4) -α-D-Glcp为主链，含有少量 的一 4, 6) -α-D-Glcp- (1 -分支的葡聚糖，平均每8个主链糖残基含有1个分支，具有W下 结构：
[0006]
[0007] 进一步的，上述卡介菌多糖，由W下方法制备：
[0008] 1)取卡介菌多糖核酸原料，去离子水溶解，上DEAE-32纤维素色谱柱，W去离子水 为洗脱剂进行洗脱；
[0009] 2)将步骤1)收集的洗脱液减压浓缩，透析袋透析，浓缩透析袋内洗脱液，冷冻干 燥，即得。
[0010] 进一步的，步骤1)中，DEAE-32纤维素色谱柱的规格为；2. 5*40畑1，用0. 5mol/L的 化Cl溶液平衡3个柱体积，再将多糖溶液样品上样，上样后吸附5小时，去离子水洗脱3个 柱体积，收集洗脱液。
[0011] 进一步的，步骤2)中的透析袋截留分子量为3000化，，透析72小时，每5小时换一 次去离子水。
[0012] 上述卡介菌多糖的结构表征方法，其特征在于，包括W下步骤：
[0013] 1)取多糖样品，采用高效凝胶渗透色谱法检测多糖的纯度和分子量；
[0014]。取多糖样品，用P2〇e干燥，经邸r压片，测定红外光谱；
[001引如取多糖样品，完全酸水解，N，0-双（立甲基娃焼）立氣己醜胺衍生，GC-MS法检 测单糖组成；
[001引 4)取多糖样品，甲基化，水解，还原，己醜化，进行GC-MS分析，推断单糖残基连接 方式；
[0017] 5)取多糖样品溶于〇2〇中，冷冻干燥，经过Η次〇2〇交换和冷冻干燥后，溶于〇2〇 中。测定核磁共振谱，检测温度为25°C。Wtrimethylsil^-propionicacid-d4为内标获 得多糖的一维ih、"cnmr谱图，W及二维相关谱伯-古cosy、ih-"c服QC)。
[0018] 进一步的，上述结构表征方法，步骤1)中采用高效凝胶渗透色谱法检测多糖的纯 度和分子量，用分子量分别为 180、2500、4600、7100、10000、21400、41100、84400、133800、 2000000化的DextranT标准品进样绘制标准曲线。进样浓度为2mg/mL的溶液，0. 45μm 滤膜过滤，取滤液50μL注入液相色谱仪；
[0019] 检测条件
[0020] Agilent1200HPLC系统；AgilentG1311A泉；AgilentG1362A示差检测器；
[0021] 色谱柱；ShodexOhpakSB-804册凝胶色谱柱
[00过色谱条件：流动相；0.Imol/L化C1 (过滤、脱气）；流速；0. 5血/min;柱温；35°C; 示差检测器温度；35°C;进样量；50ul。
[0023] 结合2)、3)、4)、5)所得的结果分析得到多糖的初级结构：该卡介菌多糖是W (1 一 4) -α-D-Glcp为主链，含有少量的一 4, 6) -α-D-Glcp-(1 -分支的葡聚糖，平均每8 个主链糖残基含有1个分支。平面结构如下：
[0024]
[0025] 本发明得到的卡介菌多糖具有通过调节机体内细胞免疫、体液免疫、增强机体抵 抗力、抗过敏等功效，临床上用于免疫调节、抗炎，抗过敏、抗肿瘤及辅助用药。本发明通过 DEAE-32纤维素色谱柱层析，透析除盐分离纯化得到卡介菌多糖，该方法操作简单高效，设 备要求低，不破坏其他有效成分。通过对分离得到的卡介菌多糖进行结构鉴定分析，为卡介 菌多糖核酸类药物的分析鉴定和研究其构效关系奠定基础。
【附图说明】：
[0026] 附图1.卡介菌多糖的HPGPC色谱图。谱图呈现单一对称峰形，表明该多糖为均一 分子量多糖。
[0027] 附图2.卡介苗多糖的单糖组成总离子流色谱图。与混合单糖总离子流色谱图对 比得知，该多糖由葡萄糖组成。图中；a)阿拉伯糖，b)核糖，c，d)葡萄糖，e)D-甘露糖
[0028] 附图3.卡介菌多糖的红外光谱图。由红红外谱图所呈现的信息得知该多糖为 α-化喃葡聚糖。
[0029] 附图4.卡介菌多糖的核磁共振氨谱。
[0030] 附图5.卡介菌多糖的核磁共振碳谱。
[0031] 附图6.卡介菌多糖的核磁共振Η-Η相关二维谱。
[003引附图7.卡介菌多糖的核磁共振C-H相关二维谱。
【具体实施方式】：
[0033] 实施例1卡介菌多糖的制备
[0034] 取卡介苗多糖核酸样品300mg适量去离子水溶解，上预先处理并用3倍柱体积的 0. 5mol/L化C1溶液平衡过得DEAE-32纤维素柱（2. 5*40畑1)，样品吸附5小时。用去离子 水洗脱3个柱体积，收集洗脱液，浓缩至适量，用透析袋（截留分子量3000Da)透析72小 时，每5小时换一次去离子水。透析袋内的溶液7(TC浓缩冷冻干燥，得到白色固体多糖，得 率为34. 2%。所得卡介菌多糖用于W下实验分析。
[0035] 理化性质及结构分析
[003引性状；白色固体，易溶于水。
[0037] 紫外吸收：在200-800nm无吸收，硫酸蔥丽法显色在630nm有强吸收峰。
[0038] 分子量及纯度：分子量约1. 78X104Da，根据面积归一法计算得知该分子量多糖纯 度为99%。
[0039] 单糖组成：葡萄糖。
[0040]红外光谱（cm1) :3417. 88, 2928. 07, 1023. 06, 1080. 12, 1154. 70, 933. 04, 847. 7 [00川多糖甲基化GC-MS分析；一 4)-Glcp-(l-构成多糖的主链，Glcp-α-为非还原 末端片段，一 4, 6)-Glcp-(1 -为分支，Η个片段的比例为：7.7:1.2:1. 1。详见表1.
[0042] 核磁共振分析；各个片段的的碳氨信号归属，详见表2.
[0043] 表1卡介菌多糖甲基化GC-MS分析结果
[0044]
[0047] 实施例2卡介菌多糖对免疫功能低下模型鼠的Τ淋己细胞亚群和细胞因子的影响
[004引1.免疫功能低下模型鼠的建立
[0049] 免疫功能低下小鼠模型是参照《抗炎免疫药物药效学指导原则.新药（西药）临 床前研究指导原则汇编（药学药理学毒理学）》完成，即每天注射氨化可的松（lOOmg/kg， ic，0.Iml/lOg体重），每日1次，共进行7天。
[0050] 2.实验分组
[0051] 试验分为4组；正常动物对照组、免疫功能低下模型组、卡介菌多糖注射组（浓度 =l.Omg/ml，多糖含量96%)、市售卡介菌多糖核酸注射液组（浓度=l.Omg/ml，多糖含量 W75%，核酸含量W15% )。
[0052] 卡介菌多糖注射组、卡介菌多糖核酸注射液组小鼠在造模前2周至造模期间，后 肢股部肌内注射相应的样品（0.Iml/lOg体重），间日一次，末次给药后24小时进行试验。 正常动物对照组后肢股部肌内每天注射生理盐水（ic，0.Iml/lOg体重），每日1次，共进行 21天。
[0053] 3.小鼠T淋己细胞亚群和细胞因子的检测
[0054] ①总T细胞％ ;常规制备淋己细胞悬液，并用RPMI1640完全培养液调细胞浓度至 4X109个/L。用生理盐水将SRBC洗3次，并用培养液调至1%浓度。在1ml塑料离必管 中，每管加入淋己细胞悬液和培养液各50μ1，37°C水浴中保温1小时。再加入SRBC悬液 100μ1混匀，37°C水浴保温10分钟。离必（80化pm, 5分钟）水浴2小时。将细胞轻轻悬 起，加100μ1 4%戊二醒固定液（用锋酸缓冲液配制）混匀。计数前将上清液全部移除，加 生理盐水100μ1和20倍稀释的1 %美藍染色液100μ1染色，20分钟后计数，即得总T细 胞％。
[0055] ②茶碱抵抗细胞花环％ ;在50μ 1淋己细胞悬液中加入含lOOmmol/L茶碱的培养 液50μ1混匀，其余步骤同上。
[0056] ⑨化、Ts细胞％;按下式计算。
[0057]
[0058]
[0059]Ts细胞％ = 100 %-Th细胞％
[0060] ④血清IFN-Y的测定：用ELISA方法，按试剂盒说明书进行。
[00川4.实验结果
[006引小鼠连续皮下注射氨化可的松（l00mg/kg，l次/日）7天，可显著降低总T细胞、 化细胞、Ts细胞数W及血浆IFN-Y水平；卡介菌多糖注射组、市售卡介菌核酸多糖核酸注 射液组可升高总T细胞、化细胞、Ts细胞数W及血浆IFN-Y水平，详见表3。
[0063] 表3卡介菌多糖对小鼠细胞免疫功能的影响（.ν±Λ.，n=9-l())
[0064]
[0065] *P<0. 05, **P<0.Olvs正常动物对照组；"P<0.Olvs免疫功能低下组；
[0066] 实施例3卡介菌多糖对豚鼠生殖器单纯疮疹病毒化SV-2)感染的影响
[0067] 1.动物模型的建立
[0068]建模方法参见度ernateinDI，etal.JInfectDis，2001 ;183(6) :844)，即首先 用生理盐水清洗外阴，干棉签磨擦阴道数次，造成阴道粘膜损伤，然后用接有灌胃针头的注 射器吸取服V-2(效价为104 一 6TCI^。，由中国科学院武汉病毒研究所提供）〇. 1ml，将针头 插入豚鼠阴道内约3~4cm将病毒注入阴道弯塵后缓慢退出，用明胶海绵塞入阴道W维持 毒液，针头上少许毒液滴在外阴，用玻璃棒轻轻涂抹均匀，使病毒渗入皮肤。
[006引2.动物分组