一种奶牛瘤胃utb基因的转录因子gata2及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种奶牛瘤胃尿素转运因子UTB基因的转录因子GATA2。
【背景技术】
[0002] 近年来，反当家畜肉和奶生产中对环境的污染问题日益受到关注。Meta分析表明， 决定奶牛粪污总氮排出的主要因素是饲粮氮摄入量，牛对饲粮氮的有效利用率只有23%， 瘤胃代谢已被确定为反当动物氮利用效率低的最重要原因。瘤胃内产生的氨除被微生物用 于合成菌体蛋白外，其余的氨经消化道上皮吸收入口静脉，随血液进入肝脏合成尿素。肝脏 中产生的尿素91 %可通过再循环重新进入消化道内，运就形成了反当动物尿素氮的再循环 利用。运种氮的再循环对维持反当动物体内氮的平衡，尤其是在低氮饲粮条件下具有重要 意义。研究表明，低氮饲粮条件下，再循环至瘤胃的尿素氮显著增加。探明氮再循环过程中 尿素转运的调控机制有利于采取针对性措施提高不同饲粮和生理条件下反当动物的氮利 用。尿素转运因子扣Ts)是高选择性快速通透尿素的膜通道蛋白分子，在牛瘤胃中表达的 尿素转运因子UTB通过参与尿素在瘤胃上皮细胞中的跨膜转运，构成了牛瘤胃尿素氮再循 环过程的重要部分，对于维持其氮平衡至关重要。UTB介导的经上皮细胞的尿素转运是经刺 激后产生的，且不受已知尿素转运因子UTA调控因子的影响。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的在于探明奶牛瘤胃UTB基因的转录因子GATA2。
[0004] 本发明的技术方案是：一种奶牛瘤胃UTB基因的转录因子GATA2,所述奶牛瘤胃 UTB基因的转录因子GATA2基因的序列如SEQIDN0. 1所示。 阳0化]所述的奶牛瘤胃UTB基因的转录因子GATA2的构建方法，（1)构建GATA2转录因 子蛋白真核表达载体，将转录因子蛋白表达载体分别与Ξ个缺失片段的UTB基因启动子载 体共转染293细胞，巧光素酶报告基因分析转录因子对于UTB启动子的转录调控作用；（2) 根据牛UTB(AY838799. 1)基因启动子信息，设计两条能够与GATA2蛋白相结合的探针并标 记，进行EMSA，确证GATA2与UTB启动子位点的特异结合。
[0006] 转录因子GATA2应用于对奶牛瘤胃UTB基因的转录调节。
[0007] 本发明的有益效果是：通过双巧光素酶报告基因系统及EMSA探明奶牛瘤胃UTB基 因的转录因子一一GATA2,对于掲示奶牛瘤胃UTB基因转录机制，探明其瘤胃氮素再循环机 理，进而提高奶牛氮素利用、降低氮素排放。
【附图说明】
[0008] 图1为UTB基因测序方向图；
[0009] 图2为部分UTB-1测序结果；
[0010] 图3为空质粒转染载体图； W11] 图4为UTB启动子载体图； 阳01引 图5为PCDNA3. 1-GATA2载体图；
[0013] 图6为部分PCDNA3. 1-GATA2测序结果；
[0014] 图7为EMSA试验结果。
【具体实施方式】
[0015] 一种奶牛瘤胃UTB基因的转录因子GATA2,所述奶牛瘤胃UTB基因的转录因子 GATA2基因的序列如沈QIDN0. 1所示。
[0016] 所述的奶牛瘤胃UTB基因的转录因子GATA2的构建方法，（1)构建GATA2转录因 子蛋白真核表达载体，将转录因子蛋白表达载体分别与Ξ个缺失片段的UTB基因启动子载 体共转染293细胞，巧光素酶报告基因分析转录因子对于UTB启动子的转录调控作用；（2) 根据牛UTB(AY838799. 1)基因启动子信息，设计两条能够与GATA2蛋白相结合的探针并标 记，进行EMSA，确证GATA2与UTB启动子位点的特异结合。
[0017] 转录因子GATA2应用于对奶牛瘤胃UTB基因的转录调节。
[0018] 本发明的有益效果是：通过双巧光素酶报告基因系统及EMSA探明奶牛瘤胃UTB基 因的转录因子一一GATA2,对于掲示奶牛瘤胃UTB基因转录机制，探明其瘤胃氮素再循环机 理，进而提高奶牛氮素利用、降低氮素排放。
[0019] 具体实验过程如下：
[0020] 1奶牛瘤胃上皮细胞UTB核屯、启动子区域的确定
[0021] 1.1试验材料
[0022] 试剂；内切酶（F'ermentas);引物Oligo(Invitrogen合成）；TaqDNA化lymer ase(109660；34,Invitrogen) ;T4DNAligase(lU/yL)GiPOOGLF'ermentas);凝胶回收试 剂盒（AP-GX_250,A巧gen) ;GeneRyLerDNALadde;r(SM0332,F'ermentas)等，质粒小抽试 剂盒（AP-MN-P-250，Ayxgen)，质粒中抽试剂盒（AP-MD-P-25，Ayxgen)，质粒大抽试剂盒 (ΑΡ-ΜΧ-Ρ-25,Ayxgen)；
[0023] 293 细胞（华大）；DMEM培养基 +10 %FBS(Invitrogen);转染试剂： lipofectamine2000(Invit;rogen);双巧光素酶报告基因检测试剂盒（Promega)。
[0024]仪器：台式冷冻离屯、机（Neofugel3R,HealF'orce)，生物安全柜 化FSafe-1800,Heal化rce)，PCR仪灯 100TM,Bio-Rad)，电泳成像系统灯anonieOO,天能）， 干式恒溫仪（TU-100C，一恒科技）溫控摇床灯监-98,太仓）等；
[00巧]Mudulus测定仪（Tu;rne;rBiosystems) ;6 孔细胞培养板（Corning) ;C02 培养箱 (Thermo);巧光显微镜（Olympus)。 阳0%] 1. 2试验方法
[0027] 1.2. 1启动子载体构建
[0028] 启动子载体构建采用PCR法，具体方法如下： 阳〇29] 设计引物
[0030] 根据根据Genbank中公布的UTB序列（AY838799. 1)，利用生物信息学方法对奶牛 UTB启动子的核酸片段进行了生物学信息分析，每个祀基因序列设计并合成2条PCR扩增引 物（带酶切位点）。
[0031] 1.2.2目的基因片段准备
[0032] (l)DNA提取：采集成年荷斯坦奶牛瘤胃上皮组织，提取基因组DM并定量。 阳03引 似PCR反应：按照W下表格配制PCR反应体系。
[0034]
[0035] 扩增条件：按照W下条件在PCR扩增仪上进行PCR反应；
[0036]
[0037]
[0038] (3)凝回收：PCR产物割取目的条带后经Axygen凝胶回收试剂盒纯化（按照产品 说明书操作）；
[0039] (4)定量：纯化后PCR产物进行0D质检并定量；
[0040] 巧)PCR产物酶切及回收纯化：按如下体系37°C水浴化，酶切后割胶回收纯化（按 照Axygen凝胶回收试剂盒说明书操作）。
[0041 ]
[0042] (6)纯化后酶切片段进行OD质检并定量。
[0043] 1. 2. 3骨架载体构建
[0044] (1)骨架载体酶切反应和回收纯化：按照下述体系37°C水浴化，酶切后胶回收 (按照Axygen胶回收试剂盒说明书操作）
[0045]
[0046] (2)纯化后酶切片段进行0D质检并定量。
[0047] 1. 2. 4连接转化与测序验证
[0048] 连接反应：按W下体系于恒溫仪上进行连接，连接条件：16°C，过夜。
[0049] 阳化0]
[0051] 1.2. 5转化、菌检和测序
[0052] (1)将连接产物转化感受态细菌，涂板过夜培养，
[0053] (2)从平板上随机挑选完全落单的菌落，用菌检PCR方法检测，
[0054] (3)挑取阳性克隆测序验证。
[0055] 1. 2. 6质粒抽提和检验 阳056] 测序正确的菌液放大培养，利用Axygen质粒抽提试剂盒和方法抽提质粒，抽提的 质粒进行0D测定。
[0057] 1.2. 7启动子载体检测
[0058] 启动子载体活性检测采用巧光素酶报告基因进行。
[0059] (1)细胞培养：于二氧化碳培养箱中用DMEM+10 %胎牛血清 (化ta化ovineserum，FB巧培养基按常规培养293细胞，维持良好生长状态； W60] 似接种：转染前一天接种6孔板，每孔细胞量约5X1〇5,培养过夜；
[OOW] 做转染：待细胞融合度达90%W上时，按转染试剂盒说明将1. 1构建的载体进行 转染，同时设立空质粒转染载体作为对照。
[0062] (4)继续培养：转染过夜后换液，并继续培养36h。 阳06引 妨裂解细胞：将细胞用PBS洗两遍，加细胞裂解液300μL，置冰上裂解lOmin，收 集裂解液，13000巧m离屯、5min;
[0064] (6)巧光素酶检测：在巧光显微镜下观察空质粒转染载体及UTB启动子载体。 W65] 1. 3结果
[0066] 1. 3. 1UTB潜在的转录因子结合位点确定
[0067] 根据Genebank中公布的UTB序列（AY838799. 1)，利用生物信息学方法对奶牛UTB 启动子的核酸片段进行了生物学信息分析，初步确定潜在的转录因子结合位点，如：GATA2 及HSF等。
[0068] 1. 3. 2UTB启动子载体的构建
[0069] 从奶牛的瘤胃上皮组织中提取基因组DNA，根据Genebank中公布的UTB序列 (AY838799. 1)分别设计Ξ段引物，引物信息见表1，在引物的两端加上油〇1和Hindlll的 酶切位点，WDNA为模板扩增包含不同区域的UTB启动子序列，分别采用油〇1和化ndnI进 行双酶切，克隆进入PGL3-basic巧光素酶报告基因载体，测序验证重组序列的方向正确， 见图1、图2,获得正确的载体：UTB-UUTB-2及UTB-3。
[0070] 表1引物序列及预计扩增片段长度
[0071]
[0072] 1. 3. 3 UTB启动子载体的检测
[0073] 在巧光显微镜下观察空质粒转染载体及UTB启动子载体，见图3及图4,可见构建 的质粒转染效果较好，转染效率较高，可用于后续试验。
[0074] 2GATA2转录因子对UTB启动子的作用
[00巧]构建GATA2转录因子蛋白真