青杄转录因子PwNF-YB3及其编码基因与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，尤其涉及青杆转录因子PWNF-YB3及其编码基因与应 用。
【背景技术】
[0002] 农作物的生产受到盐碱、干旱等非生物胁迫的影响非常严重。全世界约有20%的 耕地和50%的灌概田受到不同程度的盐害威胁，并有逐年增加的趋势。我国盐溃±地面积 约为1. 4亿亩，占耕地总面积的近7%，此外还有盐溃荒地2亿多亩。全世界干旱和半干旱 地区总面积占陆地总面积的34.9%;我国干旱、半干旱耕地面积占总面积的51%。通过转 基因提高作物的耐盐抗旱能力是一条行之有效的办法。因此，寻找与盐、干旱胁迫有关的基 因并研究其具体功能，W及调控途径具有重要的理论和实践意义。
[0003] 早期的耐盐基因工程主要集中在清除自由基和增加渗透调节物质两个方面，并且 主要通过转化单个或多个功能基因来提高转基因植株的耐盐能力，虽然转基因植株的耐盐 能力有所提高，但效果不太明显。最近，定位在细胞核内的许多调节盐胁迫下功能基因表达 的转录因子从许多植物中分离出来。研究结果表明通过送些转录因子调节后期的许多功能 基因的表达，可W大大提高转基因植株的耐盐性，从而很大程度上促进了耐盐基因工程方 面的研究工作并取得突破性进展。
[0004]NF-Y转录因子分为NF-YA，NF-Ι?和NF-YCΗ大家族。作为转录因子W其DNA结合 域与一些基因启动子区的CCAAT序列结合来调节转录活性。目前对NF-Y的转录调控机制 的研究主要是在酵母和哺乳动物中进行的，在植物中的报道只在近几年逐渐多起来。研究 表明NF-Y转录因子可参与植物的多种生长发育及多种逆境反应，目前还未见青杆NF-YB家 族成员对于其在种子萌发及幼苗抗盐耐旱方面的报道。
【发明内容】
[0005] 本发明的一个目的是提供青杆转录因子PWNF-YB3及其编码基因。
[0006] 本发明提供的蛋白，与植物抗盐耐旱相关，名称为PWNF-YB3,来源于青杆（Picea wilsoniiMast.)，是如下1)或2)的蛋白质：
[0007] 1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0008] 2)将序列表中序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或 缺失和/或添加且与植物耐逆性相关的由1)衍生的蛋白质。
[0009] 上述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸 残基的取代和/或缺失和/或添加。
[0010] 为了使1)中的PWNF-YB3便于纯化，可在由序列表中序列2所示的氨基酸序列组 成的蛋白质的氨基末端或駿基末端连接上如表1所示的标签
[0011] 表1为标签的序列
[0012]
[0013] 上述2)中的PwNF-YB3可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得 至IJ。上述2)中的PWNF-YB3的编码基因可通过将序列表1所示的DNA序列中缺失一个或几 个氨基酸的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5'端和/或3' 端连上表1所示的标签的编码序列得到。
[0014] 上述编码与植物耐逆性相关的蛋白DNA分子（名称为PWNF-YB3)也属于本发明的 保护范围之内。
[0015] 上述PWNF-YB3基因具体可为如下1)-4)中任一所述的基因：
[0016] 1)编码区为序列表中序列1所示的核巧酸；
[0017] 2)编码区为序列表中序列3所示的核巧酸；
[0018] 3)在严格条件下与1)或2)杂交且编码所述蛋白的DNA分子；；
[0019] 4)与1)或2)具有90%W上的同源性且编码所述蛋白的DNA分子；。
[0020] 上述序列1由687个核巧酸组成，可编码序列表中序列2所述的蛋白，序列3为在 序列1的两端添加酶切位点。
[0021] 上述严格条件可为用0. 1XSS阳（或0. 1XSSC)，0. 1 %SDS的溶液，在DNA或者RNA 杂交实验中65°C下杂交并洗膜。
[0022] 扩增上述PWNF-YB3基因全长或其任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。
[0023]具体如下；引物 1 ;5 '-ATGGCAGAGAACTATGGCAG-3,；
[0024]引物 2 ; 5 ' -CTACCATTGGCCCCTGGGGGCT-3，。
[00巧]含有上述PWNF-YB3基因的表达盒、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护 范围。
[0026] 含有上述PWNF-YB3基因的重组载体也属于本发明的保护范围。
[0027] 可用现有的植物表达载体构建含有PWNF-YB3基因的重组表达载体。所述植 物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等，如PCAMBIA3301、 PCAMBIA1300、PBI121、地inl9、PCAMBIA1205、PCAMBIA2301、pCAMBIA1301-UbiN或其它衍生 植物表达载体。
[0028] 使用PWNF-YB3基因构建重组表达载体时，可在其转录起始核巧酸前加上任何一 种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，如花挪菜花叶病毒（CAMV)35S启动子、泛 素扣biquitin)基因启动子（P化i)等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用； 此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增 强子，送些增强子区域可W是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序 列的阅读框相同，W保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是 广泛的，可W是天然的，也可W是合成的。翻译起始区域可W来自转录起始区域或结构基 因。
[0029]为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行 加工，如加入在植物中表达可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因（GUS基因、GFP基因、 蛮光素酶基因等）、具有抗性的抗生素标记物（庆大霉素标记物、卡郝霉素标记物等）或是 抗化学试剂标记基因（如抗除莽剂基因）等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选 择性标记基因，直接W逆境筛选转化植株。
[0030] 在本发明的实施例中，采用的表达载体为地1121，所述重组载体具体可为在 地1121的BamHI和Sail位点间插入上述PWNF-YB3基因（序列1或序列3)得到的重组表 达载体。
[0031] 本发明的另一目的在于提供一种培育转基因植物的方法。
[0032] 本发明提供的培育转基因植物的方法是将PWNF-YB3基因转入目的植物中，得到 转基因植物，所述转基因植物耐逆性高于所述目的植物。
[0033] 上述方法中，上述的DNA分子是通过上述的重组载体导入目的植物中的；上述的 PWNF-YB3基因可通过上述的重组表达载体导入目的植物中的。携带有本发明的PWNF-YB3 基因的植物表达载体可通过Ti质粒、化质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电 导、农杆菌介导等常规生物学方法转化到植物细胞或组织中。
[0034] 进一步，上述逆境是高盐环境或干旱环境。
[0035] 所述耐逆性为耐盐性和/或耐干旱性。
[0036] 所述耐逆性通过如下体现；所述转基因植物在高浓度盐或高浓度PEG的胁迫下种 子萌发率和/或幼苗根长大于所述所述目的植物。上述高盐环境具体可W是75mM、150mM、 165mM或220mM的NaCl水溶液引起的环境；上述干旱环境具体可W是100mM、200mM、300mM 或400mM的甘露醇水溶液模拟得到的干旱环境。
[0037] 上述方法中，所述植物为单子叶植物或双子叶植物，所述双子叶植物具体为拟南 芥。
[0038] 本发明的实验证明，本发明发现新基因PWNF-YB3,将其导入拟南芥中得到转 PWNF-YB3拟南芥，转PWNF-YB3拟南芥耐干旱和耐盐，具体为转PWNF-YB3拟南芥的种子在培 养基中化cl浓度为75mM、150mM、165mM和220mM时的萌发率显著高于野生型对照的种子萌 发率，在培养基中化C1浓度为165mM时幼苗的根长显著高于野生型对照的幼苗根长；并且 本发明获得的转基因拟南芥的种子在培养基中甘露醇浓度为100mM、200mM、300mM和400mM 时的的萌发率显著高于野生型对照的种子萌发率，在培养基中甘露醇浓度为300mM时幼苗 的根长显著高于野生型对照的幼苗的根长；上述结果表明，PWNF-YB3或其编码的蛋白具备 耐干旱和耐盐性。
【附图说明】
[0039] 图1为PWNF-YB3基因在青杆各组织中的表达情况
[0040] 图2为转PWNF-YB3拟南芥分子检测结果
[0041] 图3为转PwNF-YB3拟南芥和野生型拟南芥种子在165mM的化Cl处理下萌发7天 的观测结果
[0042] 图4为转PWNF-YB3拟南芥和野生型拟南芥种子在不同浓度化C1处理下萌发率测 定结果
[004引图5为转PwNF-YBS拟南芥和野生型拟南芥种子在300mM的阳G处理下萌发7天 的观测结果
[0044] 图6为转PWNF-YB3拟南芥和野生型拟南芥种子在不同浓度阳G处理下萌发率测 定结果
[0045] 图7为转PWNF-YB3拟南芥和野生型拟南芥种子萌发后转入含不同浓度化C1和 PEG的平板生长7天的根长观察结果
[0046] 图8为转PWNF-YB3拟南芥和野生型拟南芥种子萌发后转入含不同浓度化C1和 PEG的根长测定结果
【具体实施方式】
[0047] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0048] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0049] 实施例1、转录因子PwNF-YBS及其编码基因
[0050] 1、转录因子PWNF-YB3及其编码基因的获得
[0051] 青杆cDNA文库由英潍捷基（上海）公司构建完成，方法是 Gateway。利用青杆PwNF-YB3 的EST序列，W5' -CAGTCTTAAGCTCGGGCCCCA-3' 和 5, -CTCGCCGGTGATGAAACTGATG-3' 为引物进行 5，RACE-PCR;W 5' -GCTTACAGTGGTCTGAACCCTAG-3' 和 5' -CTGCCAGGAAACAGCTATGAC-3' 为引物进行和 3 'RACE-PCR扩增，将RACE-PCR产物与EST序列拼接得到cDNA全长序列，经过测序，cDNA核 巧酸序列为序列表中序列1，与Genbank中的序列进行比较，确定它属于青杆NF-YB类转录 因子，将其所示的基因命名为PWNF-YB3,编码的蛋白命名为PWNF-YB3,其氨基酸序列为序 列表中序列2。
[0052] 上述cDNA可W通过人工合成获得。
[0053] 2、通过英光定量PCR分析PWNF-YB3基因的组织表达情况
[0054] 分别提取青杆花粉、针叶、树皮和根组织的RNA，反转录合成cDNA;然 后分别W上述各组织的cDNA为模板，W5' -CAGAGAAATGGAGGGCGAGAAG-3'和 5' -ACCACTGTAAGCATTAGCATTAGAG-3，为引物进行PCR扩增，检测PwNF-YBS基因在青杆 不同组织中的表达情况。同