一种转录激活子样效应因子核酸酶及其编码基因和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种转录激活子样效应因子核酸酶及其 编码基因和应用。
【背景技术】
[0002] PPAR(过氧化物酶体增殖物激活受体）分子包括α、目和YΗ型，分布在各不同 组织，其功能涵盖范围之广是现今已知的其它生物医药分子所难W比拟的，具体包括糖尿 病、肥胖和高血压等代谢症候群，而送些疾病正是二十一世纪人类面临的主要医药卫生问 题。
[0003]PPARΥ2主要表达于脂肪组织及免疫系统，与脂肪细胞分化、机体免疫及膜岛素抵 抗关系密切，是膜岛素增敏剂喔哇焼二丽类药物（troglitazone，TZDs)作用的祀分子，成 为近年来的研究热点。
[0004] 选取哺乳动物小鼠3T3-L1细胞系（小鼠前脂肪细胞）的PPARY2基因进行目标 位点打祀，有着其特殊性。首先，PPARY2基因与人类肥胖、免疫疾病等密切相关；其次， 3T3-L1细胞在一定条件的诱导下，能分化成成熟脂肪细胞，即在分化后的细胞里能检出脂 肪粒。送样，可W无动物实验的条件下观察PPARY2基因的修饰效果。较少的花费就能进 行对人们关必的肥胖问题进行较为简单有效的研究，对人类解决送类问题有极大的参考价 值。
[0005] -直W来，生物学家在不断探索对目的基因进行定向改造和修饰。早期使用同源 重组方法，但其效率较低，通常只有10 6~10S，该方法主要在小鼠中应用，而无法在其它哺 乳动物等模式动物中得到广泛推广。
[0006] 近些年来发展很快的锋指核酸酶狂FN)应用于精确基因组修饰的方法得到了很 大发展。Ζ?^由一个DNA识别域和一个非特异性核酸内切酶（Fokl)构成。DNA识别域一般 由3~4个切s2-His2锋指蛋白（zinc-fingers)串联组成。每个锋指蛋白识别并结合一个 特异的Η联体碱基。两个ZFN分别用锋指结构域识别5' -3'方向和3' -5'方向的DNA链， 两个化kl核酸酶的催化活性功能域可W切割祀位点，激活DNA自我修复机制，达到删除该 段的目的，另一方面，切割祀位点制造出双链断裂后，细胞的修复机制被激活，DNA的同源重 组机制会将外源的同源片段复制到断裂缺口上，从而达到引入外源基因片段的目的。虽然 该方法使基因祀向修饰技术大大提高，但却存在祀向不确定、相对低效和脱祀问题。研究者 很难根据目的基因序列设计特异且高效的ZFN，而商品化的ZFN价格极昂贵，因此，在一定 程度上制约着该技术的广泛应用。
[0007] 近年来，另一种基因改造新技术--CRISPR-Cas系统也正在迅猛发展，Cong、Mali 和化0送H个课题组开展的多项研究都表明送种RNA介导的化s9系统在人类细胞当中同 样能够正常发挥作用。研究发现，对化賊性链球菌（Str巧tococ州Spyogenes)编码的化s9 内切酶进行改造之后也可W让它们在人类细胞的细胞核中被活化，然后再搭配针对人体 DNA序列设计的大约20bp长的双RNA复合体或者sgRNA，就可W对人体基因组进行定点切 割和改造。但是送种技术仍然存在严重的脱祀的问题。
[0008]转录激活子样效应因子TALE(TranscriptionActivator-UkeEffector)最早 发现于植物病原体黄单胞菌狂anthomonas)在感染植物的过程中能特异性结合到DM上， 从而实现对植物基因的相关调控。TALE送种基因定制化潜力给基因修饰带来了新突破。 TALE与化41融合后形成转录激活子样效应因子核酸酶（TranscriptionActivator-Uke EffectorNucleases,TALE化），TALE化与ZFN打祀原理相似。TALE由两侧的N-末端、C-末 端序列和中间十几个串联"蛋白模块"组成，而送些蛋白模块能特异性识别某段DM。每个 "蛋白模块"包含34个氨基酸，第12和第13位残基被称作重复可变的RVD(Repeat-Vari油le Di-resi化es)位点，每个RVDs仅能识别一个碱基，即NG识别T，皿识别C，NI识别A，順识 别G。
[0009] 目前TALE化技术已经成功应用于酵母、果觸、动物和人类细胞系、拟南芥、烟草和 水稻中。尽管已经应用于多种生物，但是由于选择的识别位点的染色体结构抑制，DNA修饰 或无效表达或者部分TALE化折叠等因素的影响，很多祀点仍然不能被检测到基因修饰或 者效率很低。并且TALE化的打祀效率在细胞研究中，很大程度上与细胞的转染效率有关， 常用细胞例如293T，外源质粒转染效率可达95%W上，而某些细胞，转染效率非常低，例如 小鼠3T3-L1细胞系一般转染只有30%，突变位点需要经过多次酶切富集等手段才能检测 出是否具有打祀活性，给TALE化打祀活性的检测带来了挑战。
【发明内容】
[0010] 本发明提供一种对小鼠PPARY2基因具有准确、高效识别功能的一对多肤，和W 该一对多肤为串联"蛋白模块"构建的一对转录激活子样效应因子（TALES)，W及将TALES 与DM切割蛋白融合而形成的一对转录激活子样效应因子核酸酶灯ALE化），该TALE化能够 准确、高效地实现对小鼠PPARY2基因的祀向修饰。
[0011] 根据本发明的第一方面，本发明提供一对多肤，该一对多肤分别具有如SEQID N0;1和SEQIDN0;2所示的氨基酸序列，或分别具有如SEQIDN0;3和SEQIDN0;4所示 的氨基酸序列。
[001引在第一方面中，一对多肤即TALES中的串联"蛋白模块"，分别识别并结合PPARY2 基因上两个有一定间隔序列（Spacer)的祀序列。其识别规则即RVDs中的NG识别T，皿识 别C，NI识别A，順识别G。具体地，SEQIDNO;1所示的多肤序列识别祀序列SEQIDNO: 27,SEQIDNO; 2所示的多肤序列识别祀序列SEQIDNO;28,SEQIDNO; 3所示的多肤序 列识别祀序列SEQIDNO;29,SEQIDNO;4所示的多肤序列识别祀序列SEQIDNO; 30。
[0013] 根据本发明的第二方面，本发明提供一对多核巧酸，该一对多核巧酸分别编码如 第一方面中的一对多肤。
[0014] 在第二方面中，由于密码子的简并性，一对多核巧酸中的每一个的碱基序列并不 唯一，只要能够编码如第一方面中的一对多肤中的一个即可。
[0015] 作为本发明的优选，在第二方面中的一对多核巧酸分别具有如SEQIDNO;5和SEQ IDN0;6所示的碱基序列，或分别具有如SEQIDN0;7和SEQIDN0;8所示的碱基序列。
[0016] 根据本发明的第Η方面，本发明提供一对蛋白质，该一对蛋白质由第一方面中的 一对多肤两端分别加上转录激活子样效应因子氨基酸序列框架的天然或经过人工改造的Ν 端和c端组成。
[0017]在第Η方面中，一对蛋白质即一对转录激活子样效应因子（TALES)，它们分别由Η 部分构成：Ν-末端序列、中间的串联"蛋白模块"（识别模块）和C-末端序列，其中，中间的 串联"蛋白模块"即第一方面中的一对多肤中的一个，Ν-末端序列和C-末端序列即转录激 活子样效应因子氨基酸序列框架Ν端和C端序列，它们可W是天然的或经过人工改造的序 列，只要能保持其功能即可。
[0018] 作为本发明的优选，在第Η方面中的一对蛋白质分别具有如SEQIDNO;9和SEQ IDN0;10所示的氨基酸序列，或分别具有如SEQIDN0;11和SEQIDN0;12所示的氨基酸 序列。SEQIDNO;9~12所示的蛋白质称作转录激活子样效应因子，其中SEQIDNO;9和 沈QIDNO;10 送对蛋白质分别命名为PPARY2-TALE-L2 和PPARY2-TALE-R2,沈QIDNO: 11和沈QIDNO;12送对蛋白质分别命名为PPARY2-TALE-L3和PPARY2-TALE-R3。
[0019] 根据本发明的第四方面，本发明提供一对多核巧酸，该一对多核巧酸分别编码如 第Η方面中的一对蛋白质。
[0020] 在第四方面中，由于密码子的简并性，一对多核巧酸中的每一个的碱基序列并不 唯一，只要能够编码如第Η方面中的一对蛋白质中的一个即可。
[0021] 作为本发明的优选，在第四方面中的一对多核巧酸分别具有如SEQIDNO;13和 SEQIDN0;14所示的碱基序列，或分别具有如SEQIDN0;15和SEQIDN0;16所示的碱基 序列。
[0022] 根据本发明的第五方面，本发明提供一对融合蛋白，该一对融合蛋白由第Η方面 中的一对蛋白质分别与DNA切割蛋白融合而成。
[0023] 在第五方面中，一对融合蛋白即一对转录激活子样效应因子核酸酶（TALE化），它 们分别由两部分构成：转录激活子样效应因子（TALES)和DNA切割蛋白，其中TALES的作用 在于识别并结合祀序列，DNA切割蛋白的作用在于切割DNA。
[0024] 作为本发明的优选，在第五方面中的DNA切割蛋白为天然的或经过人工改造的 Fok