一种基于环二腺核苷酸的衍生物、tat多肽及其在一型干扰素小分子中抑制剂的应用
【技术领域】
[0001] 本技术属于免疫学应用领域
【背景技术】
[0002] 干扰素及其杭病毒作用
[0003] 干扰素是1957年英国科学家Isaacs和Lindenmann在研究病毒干扰现象时发现 的。所谓病毒干扰现象就是一种病毒感染某个细胞后能够干扰随后的其它病毒对该细胞的 感染。最初，科学家们把灭活的流感病毒接种于鸡胚细胞内，结果发现运些细胞可W分泌一 种可溶性物质来抑制和干扰流感病毒的复制，所W将运种物质命名为干扰素。干扰素是诱 生蛋白，正常细胞一般不自发产生干扰素，只存在合成干扰素的潜能，干扰素的基因处于被 抑制的静止状态。根据干扰素的来源、生物学性质及活性可分为W下两大类。
[0004] I型干扰素：I型干扰素包括IFN-a与IFN-β等。IFN-a主要由单核-巨隧细胞 产生，此外B细胞和成纤维细胞也能合成IFN-a;IFN-e主要由成纤维细胞产生。IFN-a/ β二者结合相同受体，分布广泛，包括单核-巨隧细胞、多形核白细胞、Β细胞、Τ细胞、血业 扳、上皮细胞、内皮细胞与肿瘤细胞等。
[000引 II型干扰素：II型干扰素即丫干扰素，主要由活化的Τ细胞（包括化0、??1细胞 和几乎所有的CD8巧细胞）和ΝΚ细胞产生，是所谓的淋己因子化yTnPhokine)的一种。
[0006] -型干扰素的抗病毒活性很强，ImgIFN-a可达2亿W上国际单位，一个细胞只 要有10个甚至1个分干扰素，即可促进其自发性免疫反应从而达到产生抗病毒的状态。干 扰素既是天然的抗病毒蛋白质，且活性很强，对病毒的作用范围也很广。2005年，聚乙二醇 重组干扰素α-?通过美国抑A批准，正式用于乙肝治疗。在SARS爆发期间，干扰素对SARS 起到很好的预防和治疗作用。国内有人曾用干扰素喷剂（300IU/10ml)试用过10000多人， 也未出现不良反应，更不会引起全身发热，因此干扰素喷剂是绝对安全的。
[0007]一巧干扰素的诱导旅巧
[0008] 在未被感染的正常细胞中，一型干扰素的表达是受到抑制的。近几年来的研究掲 示了详细的一型干扰素分子诱导机制。宿主细胞内广泛存在一种可W识别细胞质内外源 DNA的受体蛋白cGAS。当病毒、细菌DNA暴露在细胞中后，该受体蛋白cGAS会与DNA结合并 激活其环化酶酶活性从而将一分子的Ξ憐酸腺巧（AT巧和一分子的Ξ憐酸鸟巧（GT巧水解 环化成2 '5'环二核巧酸C-AMP-GMP。该环二核巧酸分子进而可W和细胞内Sting效应双 分子聚合体结合，促进其构象发生改变并活化该酶分子。随后Sting激活下游的激酶TBK1 从而促进转录调控因子IRF3的活性来诱导一型干扰素的表达（图1)。
[0009] 除了细菌、病毒DNAW外，近年来研究发现，细菌合成的多种环二核巧酸，包括大 肠杆菌生成的3 '5'环二鸟巧酸和李氏杆菌生成的3 '5'环二腺巧酸均被证明可W直接和 Sting结合，从而跳过cGAS分子而直接诱导一型干扰素的高量表达。
[00…]Sting过麼激活引起的巧病
[0011] sting作为一型干扰素合成通路中至关重要的一个效应蛋白，它的表达和功能起 着至关重要的免疫平衡调节作用。最新的一些临床研究发现，Sting的过度活化和系统性 红斑狼疮等自身免疫性疾病的发病有着重要的关联。
【发明内容】
[0012] 发明目的：sting作为一型干扰素生成通路中的重要分子，它的活性在维持细胞 自发性免疫反应与炎症反应中起了至关重要的作用。因此我们通过对细菌环二腺核巧酸衍 生物筛选和定向修饰，旨在开发一系列具有良好细胞通透性的小分子，可W特异性的激活 或阻断Sting-TBKl-I型干扰素信号通路，从而达到促进（抗病毒）及抑制（过度免疫活化， 例如系统性红斑狼疮）自发性免疫反应的的作用。
[0013] 技术方案：一种环二腺核巧酸衍生物1，是3 '5'环二鸟巧酸（式I)在核糖体2位 径基位置连接了一个烘控基团（式II)，分子量为696. 4道尔顿，其结构如下：
[0014]
〇
[0015] 环二腺核巧酸衍生物1的应用，可阻断3'5'环二腺巧酸引起的人外周血细胞1型 干扰素表达分泌。
[0016] 3' 5'环二腺巧酸衍生物1-tat多肤聚合体，物质是由环二腺巧酸衍生物反应得 至IJ，其如下结构：
[0017]
[0018] 3' 5'环二腺巧酸衍生物1-tat多肤聚合体化学反应过程，在3' 5'环二腺巧酸 衍生物筛选过程中加入了烘控集团，可用于点击化学反应连接促进穿透细胞的官能团或多 肤，利用点击化学反应的方法连接了可W促进细胞膜穿透性的艾滋病病毒多肤tat,反应过 程如下：
[0019]
[0020] 其反应流程如下：
[0021] 1)在反应管中依次加入如下溶液
[0022] 3' 5'环二腺巧酸衍生物1、化S04、叠氮修饰的tat多肤如下；其中包含了 2个用 于连接的柔性甘氨酸分子和11个来源于艾滋病病毒HIVTat蛋白的穿膜多肤
[0023]叠氮（azide)N3-GGYGRKKRRQRRR
[0024] 25μ1 5mMaminoguanidine.
[00巧]25μ1 5mMsodiumascorbate
[0026] 2)将反应管关闭后颠倒混合均匀，然后放置在室溫摇床或旋转混合器上反应；
[0027] 3)反应产物用高效液相色谱HPLC进行纯化。
[0028] 3' 5'环二腺巧酸衍生物1-tat多肤聚合体应用，阻断3' 5'环二腺巧酸引起的人 外周血细胞1型干扰素表达分泌。
[0029] 有益效果：3' 5'环二腺巧酸衍生物1、3' 5'环二腺巧酸衍生物1-tat多肤聚合体 能有效降低一型干扰素在PMBC中的生成。
【附图说明】
[0030] 图l:Sting-TBKl-IRF3-型干扰素合成通路
[0031] 图2:3' 5'环二腺巧酸合成物结构及分子量
[0032]A:3' 5'环二腺巧酸合成物分子结构图B:基质辅助激光解析串联飞行时间 (MALDI)质谱分析
[0033] 图3:3' 5'环二腺巧酸衍生物1-Sting括抗剂结构及分子量
[0034]A:3'5'环二腺巧酸衍生物1-Sting括抗剂结构B:基质辅助激光解析串联飞行时 间（MLDI)质谱分析
[003引图4:3'5'环二鸟巧酸衍生物1不能刺激人外周血单个核细胞（Peripheralblood mononuclearcell,PBMC)分泌一型干扰素al地a
[0036] 图5:3' 5'环二腺巧酸衍生物1-括抗剂阻断3' 5'环二腺巧酸引起的人外周血细 胞1型干扰素表达分泌
[0037] 图6:3' 5'环二腺巧酸衍生物1与HIV tat多肤的点击化学反应 [003引图7:3' 5'环二腺巧酸衍生物1-tat细胞通透性及Sting括抗效果
【具体实施方式】
[0039] 3' 5'环二腺巧酸衍生物1-括抗剂
[0040] 3' 5'环二腺巧酸祈牛物1-枯杭剂结构及分子量
[0041] 通过化学合成的方法，我们合成了多种环二核巧酸（图2)衍生物。通过体外细胞 活性实验，我们筛选到了一个基于3 '5'环二鸟巧酸的小分子衍生物1结构（图3)。该分 子是在核糖体2位径基位置连接了一个烘控基团，分子量为696. 4道尔顿。
[0042] 3' 5'环二腺巧酸祈牛物1-枯杭剂不能引起人外周血单个核细胸巧erioheral blood mononuclearcell.PBMC)分泌1型干扰素
[0043] 通过体外活性实验我们发现3 '5'环二鸟巧酸的小分子衍生物1与3 '5'环二鸟 巧酸相比不能刺激人PBMC产生一型干扰素。具体实验步骤及结果如下
[0044]a.人外周血PBMC的制备
[0045] 1)在短中管中加入适量淋己细胞分离液。
[0046] 2)取肝素抗凝静脉血与等量RPMI1640充分混匀，用滴管沿管壁缓慢叠加于分层 液面上，注意保持清楚的界面。水平离屯、2000rpmX20分钟。
[0047] 3)离屯、后管内分为Ξ层，上层为血浆和RPMI1640液，下层主要为红细胞和粒细 胞。中层为淋己细胞分离液，在上、中层界面处有一W单个核细胞为主的白色云雾层狭窄 带，单个核细胞包括淋己细胞和单核细胞。此外，还含有血小板。
[0048] 4)用毛细血管或200μ1枪头插到云雾层，吸取单个核细胞。置入另一短中管中， 加入5倍W上体积的RPMI1640,1500巧mX10分钟，重复洗涂细胞两次。
[0049] 5)末次离屯、后，弃上清，加入含有10%小牛血清的RPMI1640,重悬细胞并计数。
[0050] b.-型干扰素诱导活性的测定
[0051] 1)将500μ1 2xl〇VmlPBMC加入到24孔细胞培养板中，然后静置于37°C含有5% C02的细胞培养箱过夜培养使之贴壁。
[005引。将不同浓度的3V环二鸟巧酸及其衍生物1与100μΜDigitonin混合，然后 加入到PBMC培养液上清中。在细胞培养箱中静置15分钟。Digitonin作为柔性非离子去 污剂可W增加细胞膜的通透性，从而帮助待测样品进入细胞内部。
[0053] 3)用预热的含有10%FBS的RPMI1640细胞培养液洗涂细胞两次，然后加入500ul 新鲜的培养液，然后放回细胞培养箱中静置培养。
[0054] 4)培养5小时候，用无菌移液器移取培养液上清。然后利用ebioscience公司的 一型干扰素alpha酶联免疫试剂盒依据标准曲线法测定培养上清中一型干扰素的浓度。[005引C.实验结果如表巧日图4,在如上的测试条件下，2μΜ的3