用于纯化抗体的连续多步骤方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及使用4种缓冲溶液的三步层析方法，其用于小规模和大规模纯化蛋白 质，具体而言单克隆抗体。
[0002] 发明背景
[0003]抗体纯化可为生物生产中的最昂贵方面之一。通常使用三步、三树脂层析过程 (在每一步骤中使用特定缓冲体系）来纯化单克隆抗体（mAb)。该惯用纯化过程涵盖捕获 步骤，随后进行离子交换步骤，且以精制步骤（polishingst印）结束，且通常耗费3至5个 工作日（包含储存和开放阶段（openphase))。在这些惯用过程中，这三个步骤在不同单元 操作组成的序列（sequence)中实施，其不能以连续模式操作，这是由于需要在每一步骤之 间调节pH、摩尔浓度和蛋白质浓度。这一惯用纯化过程示于图5中。因此，惯用纯化过程 通常需要多种不同缓冲液以及位于每一不连续步骤之间的多种储存单元。这些惯用纯化过 程因此易于产生污染、技术故障和人为错误。另外，因在用于浓缩洗脱物、调节pH和电导率 及在下一步骤前储存洗脱物的每一步骤间需要打断，且因步骤不能在完成先前步骤之前开 始，因此这些惯用纯化过程特别的长且昂贵，如在图7中可见。
[0004] 随着逐渐增加的细胞培养物滴度和更大的细胞培养体积被用于生产，下游处理被 视为工业瓶颈。其与单克隆抗体生产尤其相关，其中焦点已从批料体积转移，且转向下游处 理能力。另外，早期临床前及临床阶段研究需要较大量可更快速产生的抗体。因此，在工业 中需要可以连续模式实施的过程/方法/工艺用于抗体纯化，且用于缩短获得批料所耗费 的时间，减小污染、技术故障及人为错误的风险并减小工艺规模放大的需求。
[0005] 发明简述
[0006] 发明人发现了一种用于纯化抗体的新方法，所述方法包含呈连续模式的有限数量 的步骤，其使用减小的量的树脂和缓冲液，同时仍允许获得高产率的具有极佳纯度水平的 纯化抗体。纯化的蛋白质因此适用于医学应用。因此，所述方法可用于纯化蛋白质以供临 床试验和/或营销包含该蛋白质的药物组合物。另外，这种方法无需任何步骤间调节且因 此能够从待纯化的蛋白的收获直至最终产物都在闭合系统中实施。
[0007] 简而言之，该方法以连续模式仅包含以下三个层析步骤：一个亲和层析、一个多模 式树脂或阳离子交换层析和一个阴离子交换层析（AEX)。这三个层析步骤可以任一顺序实 施。此外，已发现在这三个层析步骤期间所使用的所有缓冲液都可从同一母液起始而制得。 有利地，这些缓冲液包含BisTris，例如与NaCl、乙酸、水和任选地NH4C1组合。因无需任 何缓冲交换，所述方法易于实施，且高度适于自动化和/或以连续模式运行。更具体地，整 个过程可仅使用4种缓冲液，确保了所有步骤之间的兼容性且允许供应链制造和质量控制 上的节约并减小储存需要。
[0008]本发明的方法进一步允许减少或废除开放阶段（即打开纯化系统以实施人工操 作（例如为新缓冲液准备层析柱、稀释样品或调节其pH)的步骤），由此减小污染风险并提 供了在较低等级的环境（lessclassifiedenvironment)中工作的可能性。此外，由于本 发明方法的每一层析步骤可使用可重复使用的树脂，或令人吃惊地可重复使用丢弃式膜吸 附剂，因此可重新开始三个层析步骤组成的序列直至获得期望的量为止，而无须人操作。具 体而言，本发明方法的所有层析步骤可使用可重复使用至少100次的树脂或使用可重复使 用至少50次的膜吸附剂来实施。发明人事实上证实了同一丢弃式膜吸附剂可在至少50次 运行的过程中使用而并不丧失稳定性。过程循环次数可由此缩短，使过程规模放大需求最 小化，且可减少操作和储存消耗，这是由于可减小树脂和缓冲液的体积且丢弃式膜吸附剂 无需在一个批次之后进行储存。因此，本发明的方法允许快速、成本有效地产生批料并减小 纯化系统所占据的时间，如在图10和12中可见（与图9和11相比）。其因此适于从工作 台规模放大至工业规模并纯化重组蛋白。
[0009] 已针对4种不同抗体来设定和实施了具体的方案。在该方案中，使在第一层析步 骤结束时获得的粗制蛋白质洗脱液直接通过第二层析基质，具体而言通过第二层析柱或膜 吸附剂，即不经任何处理（例如pH调节、缓冲交换或稀释），且使在第二层析步骤结束时获 得的蛋白质洗脱物也直接通过第三层析基质，具体而言通过第三层析柱或膜吸附剂，即不 经任何处理（例如pH调节、缓冲液交换或稀释）。该方法示于图6中。此外，在该方案中， 将含有蛋白质的溶液以连续运行加载于第一层析基质，具体而言第一层析柱或膜吸附剂上 (参见实施例6)，在先前运行从第一层析步骤洗脱后立即开始后续运行，如在图8所见。该 方案的优点为：极其快速（一个序列约2小时），实现改进的产率（大于90%)、改进的纯 度，并允许减小在使用柱时所使用的缓冲液和树脂体积，并减少在使用膜吸附剂时所使用 的缓冲液和储存设施。另外，这种过程具有极其灵活的优点，这是由于所用柱的大小和/或 运行的数目可容易地适配于待纯化蛋白的量。此外，其可完全自动化，以连续模式运行，且 其不包含任何开放阶段。另外，其已经成功地实施于4种不同抗体而无需优化。
[0010] 本发明由此提供从溶液纯化蛋白质的方法，其包含：第一层析步骤，包含使平衡缓 冲液通过第一层析基质具体而言第一层析柱或膜吸附剂，使所述溶液通过第一层析基质具 体而言第一层析柱或膜吸附剂，使平衡缓冲液通过第一层析基质具体而言第一层析柱或膜 吸附剂，使洗涤缓冲液通过第一层析基质具体而言第一层析柱或膜吸附剂，使平衡缓冲液 通过第一层析基质具体而言第一层析柱或膜吸附剂，和使用第一洗脱缓冲液从第一层析基 质具体而言从第一层析柱或膜吸附剂洗脱粗制蛋白质洗脱液；第二层析步骤，包含使平衡 缓冲液通过第二层析基质具体而言第二层析柱或膜吸附剂，使粗制蛋白质洗脱液通过第二 层析基质具体而言第二层析柱或膜吸附剂，任选地使平衡缓冲液通过第二层析基质具体而 言第二层析柱或膜吸附剂，和使用第二洗脱缓冲液从第二层析基质具体而言从第二层析柱 或膜吸附剂洗脱蛋白质洗脱物；和第三层析步骤，包含使平衡缓冲液通过第三层析基质具 体而言第三层析柱或膜吸附剂，使蛋白质洗脱物以流过模式（intheflow-throughmode) 通过第三层析基质具体而言第三层析柱或膜吸附剂，任选地使洗涤缓冲液通过第三层析基 质具体而言第三层析柱或膜吸附剂，和从第三层析基质具体而言第三层析柱或膜吸附剂的 流过液回收纯化的蛋白质。
[0011] 本发明还提供从溶液纯化蛋白质的方法，其包含：第一层析步骤，包含使平衡缓 冲液通过第一层析基质具体而言第一层析柱或膜吸附剂，使一部分溶液通过第一层析基质 具体而言第一层析柱或膜吸附剂，使平衡缓冲液通过第一层析基质具体而言第一层析柱或 膜吸附剂，使洗涤缓冲液通过第一层析基质具体而言第一层析柱或膜吸附剂，使平衡缓冲 液通过第一层析基质具体而言第一层析柱或膜吸附剂，使用第一洗脱缓冲液从第一层析 基质具体而言从第一层析柱或膜吸附剂洗脱粗制蛋白质洗脱液，和任选地使卫生缓冲液(sanitationbuffer)通过第一层析基质具体而言第一层析柱或膜吸附剂；第二层析步骤， 包含使平衡缓冲液通过第二层析基质具体而言第二层析柱或膜吸附剂，使粗制蛋白质洗脱 液通过第二层析基质具体而言第二层析柱或膜吸附剂，任选地使平衡缓冲液通过第二层析 基质具体而言第二层析柱或膜吸附剂，使用第二洗脱缓冲液从第二层析基质具体而言从第 二层析柱或膜吸附剂洗脱蛋白质洗脱物，和任选地使卫生缓冲液通过第二层析基质具体而 言第二层析柱或膜吸附剂；第三层析步骤，包含使平衡缓冲液通过第三层析基质具体而言 第三层析柱或膜吸附剂，使蛋白质洗脱物以流过模式通过第三层析基质具体而言第三层析 柱或膜吸附剂，任选地使洗涤缓冲液通过第三层析基质具体而言第三层析柱或膜吸附剂， 从第三层析基质具体而言第三层析柱或膜吸附剂的流过液回收纯化的蛋白质，和任选地使 卫生缓冲液通过第三层析基质具体而言第三层析柱或膜吸附剂；使用另一部分溶液连续重 新开始第一、第二和第三层析步骤直至使用所有溶液，并收集在每一第三层析步骤结束时 所回收的纯化的蛋白质。
[0012] 在本发明的一个实施方案中，每一缓冲液都包含BisTris。在另一个实施方案 中，每一缓冲液都包含BisTris、乙酸、NaCl、水和任选地NH4C1。在本发明方法中使用Bis Tris缓冲液尤其重要，这是由于其允许避免在三个层析步骤之间调节pH且由此在闭合系 统中从第一步骤至最后步骤运行该方法。
[0013] 在一个实施方案中，一种层析基质是蛋白质A基质。在一个实施方案中，一种层析 基质是多模式树脂或阳离子交换层析基质。在一个实施方案中，一种层析基质是阴离子交 换层析基质。
[0014] 在一个特定的实施方案中，本发明的方法包含蛋白质A层析基质、多模式树脂或 阳离子交换层析基质和阴离子交换层析基质，所述基质以任一顺序用于三个层析步骤中。
[0015] 在本发明的一个实施方案中，第一层析基质是蛋白质A基质，第二层析基质是多 模式树脂或阳离子交换层析基质且第三层析基质是阴离子交换层析基质。
[0016] 在本发明的一个实施方案中，每一层析基质是层析柱。在该实施方案的一个特定 的实施方案中，第一层析基质是蛋白质A柱，第二层析基质是多模式树脂层析柱且第三层 析基质是阴离子交换层析柱。
[0017] 在本发明的另一实施方案中，每一层析基质是层析膜吸附剂。在该实施方案的一 个特定实施方案中，第一层析基质是蛋白质A膜吸附剂，第二层析基质是阳离子交换膜吸 附剂且第三层析基质是阴离子交换膜吸附剂。
[0018] 在本发明的一个实施方案中，所纯化蛋白质是抗体。在另一个实施方案中，抗体是 单克隆抗体。
[0019] 在本发明的一个实施方案中，所述方法进一步在步骤（c)后包含纳米过滤步骤和 /或在纳米过滤步骤后包含超滤和渗滤步骤。在本发明的另一实施方案中，所述方法进一步 在步骤（c)后、在纳米过滤步骤后和/或在超滤及渗滤步骤后包含低pH灭活步骤。在本发 明的一个实施方案中，该方法在步骤（a)之前包含在液体培养基中、优选地在生物反应器 中进行细胞培养的步骤以提供含有蛋白质的液体培养基。培养的细胞可为哺乳动物、细菌 或酵母细胞。
[0020] 本发明因此还提供从液体培养基生成纯化蛋白质的整合的过程。
[0021] 在本发明的某些实施方案中，第一洗脱缓冲液包含20mMBisTris和20mMNaCl， 使用乙酸调节至pH3. 7;第二洗脱缓冲液包含20mMBisTris、45mMNaCl和25mMNH4C1， 使用乙酸调节至pH7. 25或包含20mMBisTris、80mMNaCl和25mMNH4C1，使用乙酸调节 至pH6.2;平衡缓冲液包含20mMBisTris和20mMNaCl，使用乙酸调节至pH7.4;且洗涤 缓冲液包含20mMBisTris和1MNaCl，使用乙酸调节至pH7. 4。在本发明的其他实施方 案中，卫生缓冲液包含0. 1N氢氧化钠。
[0022] 本发明提供一种试剂盒，其包含多模式树脂或阳离子交换层析基质、蛋白质A基 质和/或阴离子交换层析基质；和至少一种包含或其组成为BisTris、乙酸、NaCl、水及任 选地NH4C1的缓冲液。在一些实施方案中，该试剂盒用于使用本发明方法从溶液纯化蛋白 质。
[0023] 在一个实施方案中，该试剂盒包含多模式树脂层析柱、蛋白质A柱和/或阴离子交 换层析柱；和至少一种包含或其组成为BisTris、乙酸、NaCl、水及任选地NH4C1的缓冲液。
[0024] 在另一个实施方案中，该试剂盒包含阳离子交换膜吸附剂、蛋白质A膜吸附剂和 /或阴离子交换膜吸附剂；和至少一种包含或其组成为BisTris、乙酸、NaCl、水及任选地 NH4C1的缓冲液。
[0025] 本发明还提供一种试剂盒，其包含多模式树脂或阳离子交换层析基质、蛋白质A 基质和/或阴离子交换层析基质；和用于制备至少一种包含或其组成为BisTris、乙酸、 NaCl、水及任选地NH4C1的缓冲液的说明。在一些实施方案中，该试剂盒用于使用本发明方 法从溶液纯化蛋白质。
[0026] 在一个实施方案中，该试剂盒包含多模式树脂层析柱、蛋白质A柱和/或阴离子交 换层析柱；和用于制备至少一种包含或其组成为BisTris、乙酸、NaCl、水及任选地NH4C1的 缓冲液的说明。
[0027] 在另一个实施方案中，该试剂盒包含阳离子交换膜吸附剂、蛋白质A膜吸附剂和/ 或阴离子交换膜吸附剂；和用于制备至少一种包含或其组成为BisTris、乙酸、NaCl、水及 任选地NH4C1的缓冲液的说明。
[0028] 本发明进一步提供制备平衡缓冲液的方法，其包含产生最终浓度为20mMBis Tris和20mMNaCl的100L溶液；使用乙酸将溶液pH调节至7. 4 ;并收集25L溶液。本发明 还提供制备洗涤缓冲液的方法，其包含收集来自平衡缓冲液的制备的剩余75L溶液的25L 并向这25L溶液中添加等量的1MNaCl。本发明进一步提供制备洗脱缓冲液的方法，其包 含收集来自平衡缓冲液的制备的剩余50L溶液的25L并使用乙酸将这25L溶液的pH调节 至3. 7。本发明另外提供制备洗脱缓冲液的方法，其包含将等量（e.q.)45mMNaCl和等量 25mMNH4C1添加至来自平衡缓冲液的制备的剩余25L溶液中并使用乙酸将这25L的pH调 节至7. 25。通过本文公开的方法制得的缓冲液可用于使用本发明方法从溶液纯化蛋白质。
[0029] 本文还提供通过本文所述任一方法获得的分离蛋白质、药物作用剂和药物组合 物。
[0030] 从下列发明详述并结合所附权利要求可更全面地理解公开的纯化方法的这些和 其他特征及优势。需要注意的是权利要求的范围由其中的记载而非由说明书中对所陈述特 征和优点的具体讨论来界定。
[0031] 在本发明的上下文中，除非另外指明，否则术语"包含"、"具有"、"包含"和"含有" 应解释为开放性术语（即指"包括但不限于")。另外，术语"包含"涵盖"由......组成"（举 例而言，"包含"x的组合物可排他性地由X组成或可包含其他物质（例如X+Y))。
[0032] 附图简述
[0033] 在结合下列图阅读时，可最佳地理解公开的纯化方法的实施方案的下列详细描 述。
[0034] 图1展示用于配制实施例2至7中公开的纯化方法的缓冲液的方案示意图。
[0035] 图2展示代表用于三种NH4C1浓度的第二洗脱缓冲液的甜蜜点（sweetspots)的 图形。
[0036] 图3展示代表实施例5中15个运行中的每一个中HMW、产率、HCP和DNA的趋势分 析图。
[0037] 图4展示代表实施例8中50个运行中的每一个中HMW、LMW、HCP和DNA的趋势分 析图。
[0038] 图5展示用于纯化蛋白质的惯用过程的不同步骤示意图。BH:批量收获；EqB#l:第 一平衡缓冲液；WB#1 :第一洗涤缓冲液；E1B#1 :第一洗脱缓冲液；EqB#2 :第二平衡缓冲液； WB#2 :第二洗涤缓冲液；E1B#2 :第二洗脱缓冲液；EqB#3 :第三平衡缓冲液；WB#3 :第三洗涤 缓冲液；层析1 :第一层析步骤；层析2 :第二层析步骤；层析3 :第三层析步骤；pHadjust.: pH调节；cone,adjust.:浓度调节；conduct,adjust.:电导率调节；samp.:米样；stor.:储 存；filt.:过滤；Nanofilt.:纳米过滤；TFF:切向流过滤。
[0039] 图6展示本发明方法的不同步骤的示意图。BH:批量收获；EqB#l:第一平衡缓 冲液；WB#1 :第一洗涤缓冲液；E1B#1 :第一洗脱缓冲液；E1B#2 :第二洗脱缓冲液；层析1 : 第一层析步骤；层析2 :第二层析步骤；层析3 :第三层析步骤；samp.:采样；stor.:储存； Nanof.:纳米过滤；TFF:切向流过滤。
[0040] 图7展示包含数次运行或循环的用于纯化蛋白质的惯用过程的不同步骤示意图。 Clar.:澄清；EqB#l:第一平衡缓冲液；WB#1 :第一洗涤缓冲液；E1B#1 :第一洗脱缓冲液； EqB#2 :第二平衡缓冲液；WB#2 :第二洗涤缓冲液；E1B#2 :第二洗脱缓冲液；EqB#3 :第三平 衡缓冲液;WB#3 :第三洗涤缓冲液；层析1 :第一层析步骤；层析2 :第二层析步骤；层析3 : 第三层析步骤；Nanof.:纳米过滤；UF/DF:超滤/渗滤。
[0041] 图8展示包含数次运行或循环的本发明方法的不同步骤示意图。Clar.:澄清； EqB#l:第一平衡缓冲液；WB#1 :第一洗涤缓冲液；E1B#1 :第一洗脱缓冲液；E1B#2 :第二洗 脱缓冲液；层析1 :第一层析步骤；层析2 :第二层析步骤；层析3 :第三层析步骤；Nanof.: 纳米过滤；UF/DF:超滤/渗滤。
[0042] 图9展示包含数次运行或循环的纯化蛋白质的惯用过程中不同步骤的时间线示 意图。表中的第一行展示时间（小时）。Clar.:澄清；层析1 :第一层析步骤；层析2 :第二 层析步骤；层析3 :第三层析步骤；低pHinact.:低pH灭活；Nanof.:纳米过滤；UF/DF:超 滤/渗滤。圆代表过程完成时的时间。
[0043] 图10展示包含数次运行或循环的本发明方法的不同步骤时间线的示意图。 Clar.:澄清；层析1 :第一层析步骤；层析2 :第二层析步骤；层析3 :第三层析步骤； Nanof.:纳米过滤；UF/DF:超滤/渗滤。圆代表过程完成时的时间。