用于鉴定碳青霉烯酶基因的组合物和方法
【专利说明】用于鉴定碳青霉烯酶基因的组合物和方法
[0001] 本申请是申请号为200880016405. 7的专利的分案申请。 发明领域
[0002] 本发明涉及用于快速鉴定赋予抗生素抗性的克雷伯氏菌属（Klebsiella)细菌的 碳青霉烯酶基因的组合物和方法。
[0003] 发明背景
[0004] 肠杆菌科（Enterobacteriaceae)是一个大型的细菌科，包括较熟悉的病原体中 的许多，例如沙门氏菌属（Salmonella)细菌和大肠杆菌（Escherichiacoli)。属于肠杆菌 科的属的成员已获得了这样的名声，即将它们置于临床微生物学中最致病和最常遇到的生 物之中。这些大的革兰氏阴性杆菌常常与肠道感染相关，但可以在几乎所有的天然生境中 发现。这个科的许多成员是在人和其他动物的肠中发现的肠道微生物区系的正常部分，而 其他成员在水或土壤中发现，或者是在各种不同动物和植物上的寄生物。大肠杆菌是最重 要的模式生物之一，并且它的遗传学和生物化学已得到了仔细研究。
[0005] 肺炎克雷伯氏菌（Klebsiellapneumoniae)是在口、皮肤和肠的正常微生物区系 中发现的革兰氏阴性的、不动的、有荚膜的、发酵乳糖的、兼性厌氧的细菌。它是肠杆菌科的 克雷伯氏菌属的临床上最重要的成员。肺炎克雷伯氏菌可以引起细菌性肺炎，尽管它更通 常地牵涉医院内泌尿道和伤口感染，特别是在无免疫应答的个体中。对于老年人中的泌尿 道感染，克雷伯氏菌属的排位仅次于大肠杆菌。对于具有慢性肺病、肠致病性、鼻粘膜萎缩 和鼻硬结症的患者，它还是机会致病菌。粪便是患者感染的最重要的来源，随后为与被污染 的器具接触。随着抗生素抗性菌株持续出现，肺炎克雷伯氏菌日益成为医院感染。
[0006] 克雷伯氏菌属细菌具有染色体A类β-内酰胺酶，该酶给予其对于氨苄青霉素的 固有抗性。许多菌株已获得了超广谱β_内酰胺酶（extended-spectrumbeta-lactamase， ESBL)，其具有另外的对于羧苄青霉素、氨苄青霉素、喹诺酮类的抗性，以及逐渐增加的对于 头孢他啶的抗性。碳青霉烯抗生素已成为用于对付革兰氏阴性感染的重要试剂，特别是当 革兰氏阴性感染由不同的医院病原体引起时。
[0007] 碳青霉烯类具有任何内酰胺抗生素的最广泛的活性谱，并且通常是用于在由 多重抗性革兰氏阴性细菌引起的感染的治疗中使用的最合适的试剂。碳青霉烯类被认为 是被选择用于治疗由于具有超广谱内酰胺酶（ESBL)的肠杆菌科细菌而引起的感染的 试剂。产生ESBL的肺炎克雷伯氏菌的流行已在美国出现，并且在某些地区中接近分离物的 50%。当遇到这样高比率的产生ESBL的生物时，碳青霉烯类成为日益重要的治疗选择。在 过去数年中，已在某些地区中观察到抗碳青霉烯的革兰氏阴性菌的逐渐增加。在美国，碳青 霉稀抗性在很大程度上归于在鲍氏不动杆菌（Acinetobacterbaumannii)、铜绿假单胞菌 (Pseudomonasaeruginosa)和罕见地肺炎克雷伯氏菌的分离物中C类头孢菌素酶的表达 和外膜孔蛋白的丧失。罕见地在肺炎克雷伯氏菌中回收到了水解碳青霉烯的内酰胺酶 (碳青霉烯酶）。然而，最近在美国东北部鉴定了具有碳青霉烯酶KPC-UKPC-2和KPC-3的 分离物。这些分离物通常对于多种抗生素类别具有抗性，从而给临床医生呈现了非常有限 的治疗选择。
[0008] 引起感染暴发的高抗性生物的出现是微生物学和传染病界已研究了数年的重大 问题。目前，可以将碳青霉烯抗性肺炎克雷伯氏菌的出现添加至正在增长的高抗性生物列 表中。2005年在纽约市的多个医院中发生的碳青霉烯抗性肺炎克雷伯氏菌感染的爆发将广 泛的关注带至这些生物。
[0009] KPC酶是介导对于超广谱头孢菌素类的抗性以及对于碳青霉烯类的抗性的β-内 酰胺酶。2001年在NorthCarolina首次报道了这些碳青霉稀酶，但目前已在美国各个部分 中分离出了它们，最经常地在东海岸。产生碳青霉烯酶的分离物的检测对于疗法的更好管 理和对于感染控制是重要的。
[0010] 发明概述
[0011] 提供了用于快速且灵敏地检测赋予抗生素抗性的碳青霉烯酶基因的组合物和方 法。所述组合物包含用于检测样品中该基因的存在情况的寡核苷酸新型引物和探针组。这 些引物和探针组可以在扩增方法（例如PCR，特别是定量PCR)中使用，并且包装到试剂盒中 以用于在扩增方法中使用，以便为了检测测试样品，特别是患者样品中碳青霉烯酶基因的 存在情况，由此检测到该基因表明所述样品包含对于碳青霉烯类具有抗性的细菌。
[0012] 因此，在一个实施方案中，本发明提供了SEQIDN0 :1、2、4、5、7、8、14、15、17、18和 20中所示的新型寡核苷酸引物，以及SEQIDNO:3、6、9、16和19中所示的新型寡核苷酸探 针序列。这些序列可以在用于检测样品中的碳青霉烯酶基因的方法中使用，所述碳青霉烯 酶基因的存在表明所述样品包含具有碳青霉烯抗性的细菌。
[0013] 进一步提供了可用于检测样品中的碳青霉烯酶基因的试剂盒，其中所述试剂盒包 含根据本发明的组合物。所述试剂盒可以进一步包含关于在基于聚合酶的扩增反应（例 如，PCR或QPCR)中使用所提供的组合物的指导说明书。
[0014] 在另一个实施方案中，本发明涉及通过使用在该细菌中存在的靶核酸区域的基于 聚合酶的扩增，来检测样品中的碳青霉烯酶的方法，所述方法包括：(a)提供怀疑包含具有 碳青霉烯抗性的肠细菌的测试样品，（b)在足以提供基于聚合酶的核酸扩增产物（其包含 编码碳青霉烯酶的核苷酸序列的靶核酸区域）的条件下，使所述样品与本发明的组合物接 触；和（c)检测所述核酸扩增产物的存在情况，作为测试样品中碳青霉烯酶的存在情况的 指示。在各种实施方案中，所述测试样品是直接样品，并且本发明的方法和组合物能够在这 样的细菌浓度下检测该直接样品中碳青霉烯酶的存在情况，所述细菌浓度处于在从被那种 细菌感染的受试者中收集的样品中通常发现的细菌负荷范围之内。
[0015] 本发明还涉及根据本发明的引物的用途，其中所述引物或探针具有根据在SEQID NO:1-9和14-20和14-20中所定义的序列中任一序列的序列。
[0016] 附图简述
[0017] 图1 :关于标准PCR的灵敏度实验。还将相同的DNA稀释方案（20ng至2fg)用于 标准PCR引物。可靠的阳性判读（call)基于在所有3个重复内可靠地检测出条带的能力。 使用这个标准，对于标准PCR引物而言可靠的阳性是32pg，并因此灵敏度是32pg(l，000个 基因组等价物）。
[0018] 图2 :关于标准PCR的直接样品实验。还将从尿和血液样品中提取的DNA用于接 种标准PCR反应。在这个凝胶中未展示的是尿阴性对照样品，其在分开的凝胶上走样并且 不包含任何条带。除了阳性模板对照（positivetemplatecontrol，PTC)外，没有样品产 生条带。
[0019] 发明详述
[0020] I.概览
[0021] 本文提供了用于检测在怀疑具有产生碳青霉烯酶的细菌的样品中碳青霉烯酶的 存在情况的新型方法和组合物。由于有时低水平的酶表达或不易与其他抗性机制（例如， 不渗性或靶修饰）相区分，当使用常规易感性测试方法时，就碳青霉烯酶产生来筛选分离 物是困难的。用于检测/鉴定碳青霉烯酶的某些表型方法已在文献中进行了描述，但它们 通常不是标准化的，并且由于所需的专业水平和/或专门设备，有些对于常规临床实验室 测试来说是不可行的。科学委员会（例如CLSI)目前未给出关于用于碳青霉烯酶检测的方 法的推荐。因此，对于用于筛选包含碳青霉烯酶的细菌的快速且可靠的测试存在着需要。
[0022] 本发明的方法和组合物旨在检测和/或定量质粒承载的（plasmid-borne)β-内 酰胺酶基因，更具体地，碳青霉烯酶抗生素抗性基因的质粒，并且允许快速地鉴定这种抗生 素抗性基因。在测试样品中检测到该基因表明所述样品包含产生碳青霉烯酶的细菌。该方 法涉及使用基于聚合酶的扩增方法，特别是聚合酶链式反应。如本文中所使用的，"聚合酶 链式反应"或"PCR"是指用于扩增特定多核苷酸模板序列（或"靶核酸"）的体外方法。
[0023] 碳青霉烯酶代表了在肠杆菌科细菌中重要的新出现的抗性机制。因此，本发明的 方法可用于检测肠杆菌科成员中的碳青霉烯抗性，所述成员包括但不限于，铜绿假单胞菌、 鲍氏不动杆菌、肺炎克雷伯氏菌、产酸克雷伯氏菌（Klebsiellaoxytoca)、肠杆菌属物种 (Enterobactersp·)、肠沙门氏菌（Salmonellaenterica)、大肠杆菌等。碳青霉稀酶赋予 针对碳青霉烯类抗生素的抗性，所述碳青霉烯类抗生素包括亚胺培南、美罗培南和厄他培 南。
[0024] 本发明的组合物和方法提供了快速且有效的测试，以用于检测样品中的编码碳青 霉烯酶或水解碳青霉烯的内酰胺酶的基因，并因此检测碳青霉烯酶的存在情况。碳 青霉烯酶的检测给临床实验室提出了问题，因为碳青霉烯酶与阳性超广谱β-内酰胺酶 (ESBL)确证测试（由克拉维酸盐加强的头孢曲松、头孢他啶、头孢吡肟和氨曲南的活性）相 关。因此，无法识别对亚胺培南或美罗培南易感的分离物中减少的碳青霉烯易感性的意义 可以导致这些分离物被不正确地鉴定为ESBL产生者。
[0025] II.组合物
[0026] 核苷酸序列
[0027] 来自几种肺炎克雷伯氏菌分离物的碳青霉烯酶的核苷酸序列提供在SEQIDΝ0: 10-13中。还将本发明的引物和探针序列提供为SEQIDNO:1-9和14-20。所述引物和探 针组包括SEQIDN0:1中所示的正向引物，SEQIDN0:2中所示的反向引物，和SEQIDN0: 3中所示的核酸探针；SEQIDNO:4中所示的正向引物，SEQIDNO:5中所示的反向引物，和 SEQIDN0 :6中所示的核酸探针；SEQIDN0 :7中所示的正向引物，SEQIDN0 :8中所示的 反向引物，和SEQIDN0 :9中所示的核酸探针；SEQIDN0 :14中所示的正向引物，SEQID NO:2中所示的反向引物，和SEQIDNO:3中所示的核酸探针；SEQIDNO:4中所示的正向引 物，SEQIDN0 :15中所示的反向引物，和SEQIDN0 :16中所示的核酸探针；SEQIDN0 :20 中所示的正向引物，SEQIDNO:8中所示的反向引物，和SEQIDNO:9中所示的核酸探针； 以及SEQIDNO:17中所示的正向引物，SEQIDNO:18中所示的反向引物，和SEQIDNO:19 中所示的核酸探针。这些引物和探针组可以在基于聚合酶的扩增方法（例如，实时PCR方 法）中使用，以用于快速地鉴定碳青霉烯酶抗生素抗性基因。所述引物和探针组是通用的， 因为它们可以识别肺炎克雷伯氏菌碳青霉烯酶（KPC)基因的所有已知的同种型，以及检测 其他肠细菌中的碳青霉烯酶基因。尽管鉴定了特定的引物和探针序列，但应当认识到所述 序列可以通过核苷酸的添加或置换而发生改变。
[0028] 样品来源
[0029] 可以在实践本发明的方法中使用的代表性生物样品包括鼻拭子、咽喉拭子、粪便、 皮肤拭子、血液（包括血液培养物）、痰、细支气管肺泡灌洗液、支气管吸出物、肺组织和尿。 生物样品的收集和贮存方法是本领域技术人员已知的。可以通过铺板和使细菌生长来对生 物样品进行加工。在一个优选的实施方案中，所述样品是直接样品，并且使所述直接样品直 接与PCR反应组分和合适的寡核苷酸接触。所述方法特别可用于检测体液例如血液和尿中 碳青霉烯酶的存在情况。
[0030] "直接样品"是这样的样品，其收集自受试者并且无需从样品中分离或培养细菌而 在PCR反应中进行筛选。直接样品在筛选前一般仅最低限度地进行加工。在各种实施方案 中，样品可以使用本领域已知的任何可接受的方法来进行裂解，并且进行离心以去除细胞 碎片。保留上清液用于筛选。在另一个实施方案中，在PCR方法中进行筛选之前，使核酸形 成粒状沉淀，洗涤，并重悬浮于合适的缓冲液中。
[0031] 寡核苷酸引物
[0032] 在本发明的一个实施方案中，将寡核苷酸引物提供用于检测样品中的碳青霉烯酶 抗生素抗性基因。如本文中所使用的，"引物"是指这样类型的寡核苷酸，其具有或包含与在 碳青霉烯酶基因中存在的或衍生自碳青霉烯酶基因的靶多核苷酸互补的序列，并且其通过 碱基配对与靶多核苷酸杂交。在一个实施方案中，本发明的正向和反向引物是包含SEQID NO:1、2、4、5、7、8、14、15、17、18和20中所示的核苷酸序列的那些。术语"寡核苷酸"是指 短的多核苷酸，长度通常小于或等于150个核苷酸（例如，长度为5-150个，优选地10-100 个，更优选地15-50个核苷酸）。然而，如本文中所使用的，该术语还意欲包括更长或更短的 多核苷酸链。
[0033] 本发明的引物和探针组被设计为用于检测编码碳青霉烯酶的核酸分子。本发明的 组合物被设计为用于检测编码碳青霉烯酶的核酸序列的5'、3'和中间部分。本发明的引物 和探针组中的每一个可以识别碳青霉烯酶基因的所有已知的同