一组不同启动子介导的蛋白酶高通量筛选载体及筛选方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及的是蛋白酶高通量筛选技术，具体涉及一组不同启动子介导的蛋白酶 高通量筛选载体及筛选方法，属于生物工程技术领域。
【背景技术】
[0002] 蛋白酶是指通过断裂氨基酸的酰胺键来水解蛋白质的一类酶。蛋白酶的种类很 多，如胃蛋白酶、胰蛋白酶、组织蛋白酶、木瓜蛋白酶等，这些酶在工业生产及日常生活中都 有着广泛的应用。随着蛋白酶的需求量日益剧增，蛋白酶的筛选方法也在不断探索更新。
[0003] 先前的蛋白酶筛选方法中，主要是通过观看水解圈的有无及水解圈的大小来筛选 目标蛋白酶，这种方法操作简单但工作量大，使用范围很局限，只适合小量筛选蛋白酶。随 后在分子生物学的基础上，研究人员为了获得高活性的蛋白酶，通过分子改造，构建蛋白酶 突变体库，水解圈筛选蛋白酶的方法已经远远不能满足此需求。在这种技术需求下，高通量 筛选应运而生。
[0004] 蛋白酶高通量筛选是指在细胞水平上运用自动化仪器，经计算机分析处理数据， 最终收集样品。这种方法具有高度灵敏性、操作样品量大等优势，在蛋白酶定向进化过程中 大大缩短了筛选时间，减少了工作量。
[0005] 在高通量筛选蛋白酶的方法发展历程中，Dr.Yi构建了一种带有双向启动子 的质粒pESD[Yi,L.，Gebhard,M.C.，Li,Q.，Taft,J.M.，Georgiou,G.，andIverson,B. L."EngineeringofTEVproteasevariantsbyyeastERsequestration screening(YESS)ofcombinatoriallibraries>, ,Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A.，2013, 110(18) :7229-34]。在该载体中，蛋白酶基因及其底物基因分列于可被半 乳糖诱导的双向启动子GAL1-GAL10两端，同时紧靠底物基因的两端带有特异性标记基 因FLAG和HA。底物基因与其两端带有的特异性标记基因连接在酵母细胞表面展示蛋白 Aga2基因之后，从而其蛋白表达产物可被Aga2转运到表面。FLAG基因的氨基酸序列为 DYKDDDDK，而HA基因的氨基酸序列为YPYDVPDYA。在FLAG基因与HA基因的蛋白表达产物 成功展示在酵母表面后，基于其氨基酸序列的特异性，其蛋白产物能被带有不同荧光分子 的特异性抗体所识别，从而给予酵母细胞相应的荧光。根据蛋白酶与底物是否有酶切反应 使酵母细胞具有不同荧光，这些带有不同荧光的酵母细胞通过流式细胞仪分析，可以根据 不同的目的要求筛选富集特定的细胞得到高特异性和高活性的蛋白酶突变株。这种方法虽 然能够广泛用于蛋白酶突变株的筛选，但是其广谱性仍存在不足，主要表现在酶动力学检 测范围的局限性。
[0006] 在Yi.的实验中，使用的双向启动子GAL1-GAL10的转录强度为4:5,转录表达的 酶与底物的浓度比例接近1:1，这样的浓度比例极大地限制了此方法的酶动力学检测范围， 具体为：1、具有高活性的酶无法运用此方法；2、无法有效筛选出高活性的突变体；3、无法 精细调控突变体筛选过程。为解决这些问题，控制酶与底物的浓度比例，获得更加广泛的筛 选范围成为一个行之有效的方法。利用荧光定量检测来比较酵母细胞中启动子调控转录 的强弱，已分析出在不同启动子之间有不同的相对的转录强度比例[JohnBlazeck,Rishi Garg,BenReed,HalS.Alper."ControllingPromoterStrengthandRegulationin SaccharomycescerevisiaeUsingSyntheticHybridPromoters'，，Biotechnologyand Bioengineering, 2012, 109 (11) : 2884]，如与GAL1启动子相比，有4种启动子的转录强度 比例分别为GAL1-A:GAL1 为 1/4、GAL1-B:GAL1 为 1/12. 5、GAL1-C:GAL1 为 1/25、GAL1-D: GAL1为1/50使用这些启动子可以精确控制酶与底物的不同浓度比，从而逐步提高蛋白酶 的酶活来达到最终筛选获得高活性蛋白酶的目的。
【发明内容】
[0007] 本发明的第一个目的是提供一组高通量筛选载体pBDYD-GALX，即在pESD载体的 双向启动子基础上，将控制底物表达的双向启动子GAL1-GAL10两端均连接表面展示蛋白 Aga2和抗体标签FLAG和HA，在载体上再分别加入一种相对转录强度确定的启动子GALX控 制酶的表达，根据启动子GALX的不同，能准确调节蛋白酶与其底物浓度比例在1:2至1:100 之间变化，从而有效地扩大了酶动力学范围。
[0008] 具体地，本发明的第一个目的是这样实现的：一组用于蛋白酶高通量筛选的空白 重组载体，该空白重组载体为pBDYD-GALX，其结构为GALX-pESD-HA-FLAG-Aga2-GAL1/ GAL10-Aga2 -FLAG-HA，所述的GALX为控制蛋白酶按照不同强度表达的启动子，所述的 GAL1/GAL10为控制底物表达的双向启动子，所述的Aga2为表面展示蛋白，所述的FLAG和 HA为抗体标签；根据启动子GALX的不同，该重组载体通能调节蛋白酶与其底物浓度比例在 1:2至1:100之间变化。
[0009] 优选地，如上所述用于蛋白酶高通量筛选的空白重组载体，其中的GALX包括 Gal4pBS2、Gal4pBS2/4、Gal4pBSl、Gal4pBS3、GAL1、LEUM、TEF、CYC、GPD。
[0010] 在本发明的实施例中构建了五种不同GALX启动子强度的空白重组载体，分别命 名为BD1、BD2、BD3、BD4、BD5,五种载体上都没有底物和酶的序列，只是启动子转录强度有所 差异。其中BD1质粒的酶部分的启动子GALX转录强度是底物部分启动子GAL1强度的1/50， 即意味着酶的表达量是底物表达量的1/100 ;BD2质粒表达的酶量是底物量的1/50 ;BD3质 粒表达的酶量是底物量的1/25 ;BD4质粒表达的酶量是底物量的1/8 ;BD5质粒表达的酶量 是底物量的1/2。
[0011] 本发明还提供了 一组含有酶和底物片段的蛋白酶高通量筛选载体，该蛋白酶 高通量筛选载体的结构为GALX-protease-pESD-HA-substrate-FLAG_Aga2_GALl/ GAL10-Aga2 -FLAG-substrate-HA，所述的GALX为控制蛋白酶按照不同强度表达的启动 子，所述的GAL1/GAL10为控制底物表达的双向启动子，所述的Aga2为表面展示蛋白，所述 的FLAG和HA为抗体标签，所述的protease为蛋白酶，所述的substrate为底物；根据启动 子GALX的不同，该载体能调节蛋白酶与其底物浓度比例在1:2至1:100之间变化。
[0012] 本发明的第二个目的是提供一种采用上述载体进行高通量蛋白酶筛选的方法，利 用高通量筛选载体，在双向启动子GAL1-GAL10两端均连接底物序列和启动子GALX后插入 Fast-TEV酶，利用荧光抗体FLAG(anti-FLAG-APC)和HA(anti-HA-FITC)的信号强弱来区分 蛋白酶的酶切效率，并结合流式细胞仪筛选分析酶切结果。
[0013]具体地，本发明的第二个目的是这样实现的：
[0014] -种蛋白酶高通量筛选方法，该方法包括如下步骤：
[0015] A、构建权利要求1所述的不同GALX的空白重组载体；
[0016] B、在步骤A所得空白重组载体的基础上，通过添加蛋白酶和底物的基因片段构建 权利要求2所述的蛋白酶高通量筛选载体，并转化得到含不同转录强度启动子的高通量筛 选工程菌；
[0017] C、含不同转录强度启动子的高通量筛选工程菌的诱导表达；
[0018] D、流式细胞仪检测底物与酶在不同比例时的荧光信号强度，从而得到高活性的蛋 白酶突变体。
[0019] 优选地，如上所述的蛋白酶高通量筛选方法，其中步骤A中的构建方法包括如下 步骤：
[0020] (1)采用PCR克隆方法得到GAL10启动子端连接的Aga2-FLAG-HA复合体的基因片 段；
[0021] (2)将步骤⑴获得的PCR产物回收后，用限制性核酸内切酶SalI和NdeI 双酶切，再与经过限制性核酸内切酶SalI和NdeI双酶切后的载体pESD酶连；酶 连产物直接转化到大肠杆菌感受态细胞中，挑选转化子经测序验证，得到重组质粒 pESD-HA-FLAG-Aga2-GALl/GAL10-Aga2-FLAG-HA；
[0022] (3)采用PCR克隆方法得到多种不同转录强度的启动子GALX的基因片段；
[0023] (4)将步骤⑶获得的PCR产物回收后，用限制性内切酶EcoRI和ΚρηI双酶切， 再与经过限制性核酸内切酶EcoRI和ΚρηI双酶切的步骤（2)的重组质粒酶连；酶连产物