一种外源基因敲入乳酸乳球菌快速筛选系统及其构建方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属生物技术，具体说是将一个外源基因克隆到乳酸乳球菌（Lactococcus lactis，L. lactis)染色体上的新方法，该方法利用lacZ基因的表型特征，使筛选外源基因 敲入株更加方便快捷。
【背景技术】
[0002] 乳酸乳球菌（Lactococcus lactis，L. Lactis)是一种非侵入性、非致病性的食品 安全级革兰阳性球菌，传统上被用于多种食品（例如奶酪、黄油等）的生产之中。由于其重 要的应用价值，从20世纪80年代开始，乳酸乳球菌得到广泛而深入的研究，其生化、免疫 以及遗传背景已研究得比较清楚。由于其良好的安全性，乳酸乳球菌被广泛用于表达各种 外源蛋白，包括各种酶、治疗性蛋白产品和疫苗组分，应用于食品工业、生物制药和疫苗研 制等领域，具有重要的经济价值。其中，乳酸乳球菌乳脂亚种（L. lactis subsp. cremoris) MG1363和NZ9000,应用得最为广泛。MG1363菌株具有生长迅速、遗传操作简便、外源基因导 入稳定等特点，并有大量的遗传学工具。NZ9000是MG1363的衍生菌株，是在MG1363的p印N 基因中插入了 nisRK基因。该基因的产物能在微量的食品安全级抗菌肽nisin的诱导下， 增强PnisZ启动子下游基因的过表达，蛋白表达量可达到生产级。因此，NZ9000被当做"细 菌工厂"，用于生产多种多样的异源蛋白。由于乳酸乳球菌具有一般安全级（GRAS)性质，同 时它不属于正常菌群，只在消化道内短期定植，因此NZ9000特别适于作为载体表达异源蛋 白，可直接用于人或动物的消化道。
[0003]在乳酸乳球菌中表达外源蛋白，可将目的基因克隆到质粒或者细菌染色体上两个 方式，其中克隆到染色体上的方式更适宜，因为外源基因更为稳定，且不引入耐药基因。克 隆的方式通常采用同源重组敲入（knock in)，需要在质粒上构建针对敲入位点的两个同源 臂，而目的基因则位于上下游同源臂之间。敲入过程有两个步骤：首先将质粒转入乳酸乳球 菌，通过单交换同源重组，整个质粒整合到细菌基因组敲入位点，整合子通过质粒的耐药标 记被筛选出来。然后将整合子在不含抗生素的培养基中传代，此时部分细菌会发生双交换 同源重组，整合的质粒被切离，同时质粒上的外源基因取代敲入位点序列，完成外源基因在 染色体上的克隆。对双交换同源重组的筛选，一般是以质粒携带的耐药标志存在与否来进 行初步判断，即挑选大量传代细菌克隆，检测其是否仍具有耐药性，失去耐药性的克隆即为 发生了双交换同源重组的克隆；进一步检测该克隆的基因组上是否存在目的基因。由于双 交换同源重组是一个小概率事件，往往要挑选成千上万个克隆才能筛选到目的菌株，工作 量非常大，费时费力。
【发明内容】
[0004] 为了能够简化筛选步骤，本发明的目的是提供一种可以通过直观观察的筛选标 记，最大程度地减少筛选工作量的筛选系统。为了达到这个目的，发明人在乳酸乳球菌染色 体上敲入了一个lacZ基因，将其作为敲入位点，由于lacZ基因的编码产物是半乳糖苷酶， 可分解X-Gal (5-溴-4-氯-3-吲哚-3-D半乳糖苷）产生蓝色产物，使菌落在含有X-Gal 的固体培养基上呈蓝色。而如果lacZ基因被敲入的外源基因取代，该蓝色表型则消失，菌 落呈白色。这种蓝-白色的变化，可以在培养固体培养基上直观地观察到，因此大大减少筛 选的工作量和时间，简化克隆步骤。
[0005] 本发明的技术方案是：
[0006] 为实现上述目的，本发明提供如下的技术方案：
[0007] -种外源基因敲入乳酸乳球菌的快速筛选系统，所述筛选系统包括温敏质粒和乳 酸乳球菌；其中，所述温敏质粒包含his基因片段和温敏复制子-红霉素抗性基因（Ts-Enf) 片段；所述乳酸乳球菌的染色体上包含lacZ基因表达片段；优选地，所述his基因片段的 序列为SEQ ID N0:2;更优选地，所述温敏复制子-红霉素抗性基因（Ts-EnO片段的序列 为SEQ ID N0 :5;尤其优选地，所述lacZ基因表达片段的核苷酸序列为SEQ ID N0 :12。
[0008] 在根据本发明的一个实施方案中，所述温敏质粒是以pUC18质粒为骨架质粒构建 的。
[0009] 在根据本发明的一个实施方案中，所述温敏质粒的核苷酸序列为SEQ ID N0 :1。
[0010] 本发明还提供了上述筛选系统的构建方法，所述方法包括：
[0011] 1)提供骨架质粒，将his基因片段和温敏复制子-红霉素抗性基因（Ts-Enf)片段 连接到所述骨架质粒中得到温敏质粒；优选地，所述骨架质粒为PUC18质粒；
[0012] 2)将lacZ基因的表达片段通过同源重组的方法导入到乳酸乳球菌染色体上得到 染色体上含有lacZ基因的表达片段的乳酸乳球菌；
[0013] 优选地，所述his基因片段的序列为SEQIDN0 :2;更优选地，所述温敏复制子-红 霉素抗性基因（Ts-Enf)片段的序列为SEQIDN0 :5;尤其优选地，所述lacZ基因表达片段 的核苷酸序列为SEQIDN0 :12。
[0014] 在根据本发明的一个实施方案中，步骤1)所述的温敏质粒是通过包括下述步骤 的方法实现的：
[0015] a)以序列为SEQIDN0 :18的引物HisF和序列为SEQIDN0 :19的引物HisR扩 增乳酸乳球菌NZ9000的his基因，将获得的基因序列克隆到骨架质粒中；
[0016] b)以序列为SEQIDN0:20的引物TsF和序列为SEQIDN0:21的引物TsR扩增 质粒pCrePA2的Ts-Enf片段，并将获得的Ts-Em1'片段克隆到经步骤1)处理的骨架质粒中；
[0017] c)经氨苄青霉素抗性筛选，取阳性克隆提取，即得温敏质粒。
[0018] 在根据本发明的一个实施方案中，步骤a)中将所述his基因序列克隆到pUC18质 粒的EcoRI-Smal酶切位点。
[0019] 在根据本发明的一个实施方案中，步骤b)中将所述Ts-Enf片段克隆到pUC18质 粒的BamHI-PstI酶切位点。
[0020] 在根据本发明的一个实施方案中，步骤2)所述的染色体上含有lacZ基因的表达 片段的乳酸乳球菌是通过包括下述步骤的方法实现的：
[0021] d)合成序列为SEQ ID N0:6的启动子？^，以序列为SEQ ID N0:22的引物PZF 和序列为SEQ ID NO :23的引物PZR扩增PnisZ，获得Pnis^扩增产物；同时以序列为SEQ ID NO :24的引物LF和序列为SEQ ID NO :25的引物LR扩增lacZ基因，获得lacZ基因的扩增 产物；
[0022] e)将步骤d)得到的PnisZ的扩增产物与lacZ基因的扩增产物等比例混合作为模 板，然后以PZF和LR为引物扩增，获得序列为SEQ ID N0 :9的PZL片段；
[0023] f)将步骤e)得到的PZL片段插入序列为SEQ ID N0:10的pMG36e质粒的 EcoRI-Xbal位点，通过红霉素抗性LB固体培养基筛选阳性克隆，酶切鉴定后提取得到质粒 pMG36e-PZL ；
[0024] g)以pMG36e-PZL质粒为模板，序列为SEQ ID N0:22的PZRec和序列为SEQ ID NO :22的TerRec为引物，扩增得到序列为SEQ ID NO :11的PZLT片段，然后将所述PZLT片 段克隆入线性化PJW质粒的AscI位点中，通过氨苄青霉素抗性固体培养基筛选阳性克隆， 经酶切、测序鉴定后，提取得到序列为SEQ ID N0 :11的pJW-PZLT质粒；
[0025] h)将步骤g)得到的pJW-PZLT质粒转化受体菌NZ9000,然后先将获得的细菌在红 霉素抗性培养基Ml7GS中以38. 5 °C的高温培养，再在无抗性Ml7GS培养基中以25 °C的低温 培养，之后将低温培养得到的培养液经适当稀释后涂布于无抗性的含有40 μ g/mL的X-Gal 和0. 1 μ g/mL的nisin的M17GS固体培养基上，然后对获得的蓝色菌落进行红霉素抗性筛 选；筛选到的无红霉素抗性蓝色克隆经鉴定即得到PZLT片段敲入株PZLTNZ。
[0026] 本发明进一步提供了上述筛选系统在快速筛选敲入乳酸乳球菌的外源基因中的 应用，其特征在于，所述应用为：将外源基因插入到所述温敏质粒的his基因片段的中间， 使his基因片段在外源基因两侧形成同源臂，获得含有外源基因的温敏质粒；然后将所述 含有外源基因的温敏质粒转化到染色体上包含lacZ基因表达片段的乳酸乳球菌中，诱导 同源重组；以含有X-Gal的培养基进行筛选，其中白色菌落即是成功敲入外源基因的乳酸 乳球菌的菌落。
[0027] 在根据本发明的一个实施方案中，所述外源基因为序列为SEQIDN0:14的SACNP 基因。
[0028] 由于采用了上述技术方案，本发明具有如下的优点：
[0029]目前将外源基因克隆到乳酸乳球菌染色体上的方法，存在筛选工作量大，费时费 力，效率低下的问题。本发明针对这个问题，提供了一种利用菌落颜色的变化来快速筛选出 阳性克隆的快速筛选系统。本发明通过在乳酸乳球菌的染色体上插入了一个lacZ基因，将 其作为敲入位点，由于lacZ基因的编码产物是半乳糖苷酶，可分解X-Gal产生蓝色产物，使 菌落在含有X-Gal的平板上呈蓝色。而如果lacZ基因被敲入的外源基因取代，该蓝色表型 则消失，菌落呈白色。这种蓝-白色的变化，可以在培养平板上直观地观察到，因此大大减 少筛选的工作量和时间。
【附图说明】
[0030] 图1为温敏质粒PJW的图谱及其构建。其中his为乳酸乳球菌NZ9000的his (组 氨酸合成酶）基因，用作同源重组双交换的左右臂；Ts Ori为来自pCrePA2质粒的温敏复 制子；〇ri为来自pUC18质粒的复制子;MCS为多克隆位点；Enf为红霉素抗性基因；Ap"为氨 苄青霉素抗性基因；P(Enf)为红霉素抗性基因启动子；PApD为氨苄青霉素抗性基因启动 子。〇
[0031] 图2为lacZ基因表达片段PZLT敲入质粒pJW-PZLT的构建。其中his为乳酸乳球 菌NZ9000的his (组氨酸合成酶）基因，用作同源重组双交换的左右臂；Hisa和Hisb，his 基因经AscI酶切后的两个片段，作为同源重组双交换的左右臂；Ts Ori为来自pCrePA2质 粒的温敏复制子；Ori为来自pUC18质粒的复制子；Ori o