一种烟草病程相关蛋白pr10基因的特异性pcr引物及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子生物学领域，特别是涉及一种烟草病程相关蛋白PR10基因的特 异性PCR引物及其应用。
【背景技术】
[0002] 病程相关蛋白（Pathogenesis-RelatedProteins,PRproteins)是植物体内的一 类蛋白质，受病原体或其他外界因子的胁迫而诱导表达，在植物抵御疾病、响应外界压力以 及适应不良环境方面发挥着重要作用。根据病程相关蛋白家族成员的氨基酸组成、结构及 生物学功能等特点，将其分为17类，即PR1~PR17,其中，PR10蛋白因其具有核酸酶活性及 抑菌活性成为了研究热点。PR10蛋白最先是在用激发子处理过的欧芹培养细胞中发现的， 后来在辣椒、花生、水稻、刺茄、菊花、小麦、葡萄和苜蓿等20多种植物中，发现了其家族成 员，并进行了基因序列特征和相关功能的研究。研究表明，PR10作为逆境应答蛋白广泛存 在于高等植物基因组中，大部分物种的蛋白氨基酸序列具有与核酸酶活性有关的"P-L00P" 结构域，分子量在15~19kD之间，等电点偏酸性，无信号肽序列、属胞内蛋白。
[0003] 近年来，很多研究证实了PR10蛋白具有核酸酶活性和抑菌活性。Park等研究证 实，辣椒PR10蛋白（CaPRIO)比非磷酸化的CaPRIO具有更高的核酸酶活性，并发现这种核 酸酶活性在抗病毒途径中能降解病毒RNA，抑制病毒侵染。He等发现，从葡萄中分离的PR10 蛋白（VpPRIO. 2)同时具有DNA酶活性和RNA酶活性。从花生中克隆的AhPRIO基因，其原 核表达的融合蛋白具有抗F.oxysporum和R.solani活性。辣椒和刺前的PR10蛋白也被证 实具有体外抑菌活性。但是，并不是所有的植物PR10蛋白都具有核酸酶活性，从人参、黄羽 扇豆、棉花、红薯、辣椒、刺茄和花生中分离纯化的PR10蛋白均证实具有体外核酸酶活性， 而从马铃薯、西芹和苜蓿中分离纯化的PR10蛋白却无体外核酸酶活性，这可能与PR10家族 不同成员性质差异和结构差异相关。
[0004]CN101781655A公开了水稻XIOsPRIO基因序列、基因编码蛋白序列、基因在RNA 酶切降解中的应用、基因超表达载体的构建方法和水稻的遗传转化方法以及在转基因水稻 中超表达的应用。通过RT-PCR从水稻扩增出XIOsPRIO基因，原核表达水稻XIOsPRIO基因 的产物具有RNase活性，可以用于RNA酶切降解，通过水稻遗传转化，获得的XIOsPRIO基因 超表达转基因水稻植株，提高了水稻对细菌性条斑病的抗性。烟草是重要的模式植物，但未 见关于PR10蛋白特征和功能的研究报道。
【发明内容】
[0005] 本发明致力于获得从烟草中克隆得到的烟草病程相关蛋白PR10原核表达融合蛋 白，并进行功能验证及分析，本发明提供了一种烟草病程相关蛋白PR10基因的特异性PCR 引物及其应用。
[0006] 为达此目的，本发明采用以下技术方案：
[0007] 第一方面，本发明提供了烟草病程相关蛋白PR10基因的特异性PCR扩增引物，所 述PCR扩增引物的序列包括：SEQIDNO. 1所示核苷酸序列的上游引物和SEQIDN0. 2所 示核苷酸序列的下游引物；
[0008] 所述SEQIDNO. 1所示的核苷酸序列的上游引物如下：5'-CATCATCATCATCATCATA TGGGTGTCACAACCTATACTCATG-3'，其中下划线部分为pColdll载体NdeI酶切位点及其上游 部分序列。
[0009] 所述SEQIDN0. 2所示核苷酸序列的下游引物如下：5'-AGACTGCAGGTCGACAAGCTT TTAGGCATAGACGGTAGAATTGG-3'，其中下划线部分为为pColdll载体HindIII酶切位点及其下 游部分序列。
[0010] 本发明中，通过所述引物可克隆出烟草病程相关蛋白，所述引物具有和载体相同 的一段同源臂，且上游引物含有限制性内切酶位点NdeI，下游引物具有限制性内切酶位 点HindIII，从而可与经过NdeI和HindIII双酶切pColdll载体实现无缝克隆，同时上游引 物含有翻译起始密码子ATG，下游引物含有翻译终止密码子TAA，可使扩增序列包含完整的 开放阅读框，实现蛋白翻译的起始和终止。
[0011] 优选地，所述引物扩增出的烟草病程相关蛋白的基因序列为SEQIDN0. 3所示的 核苷酸序列；
[0012] 所述SEQIDN0. 3所示的核苷酸序列如下：
[0013]ATGGGTGTCACAACCTATACTCATGAGGCATCAACCACAGTTGCCCCAACTAGATTATTCAAAGCTTTG GTTCTTGATGCAGATAACCTTATTCCAAAATTGATGCCACAAGTTGTTAAGAACATTGAGACTGTCGAAGGTGATGG TGGTGTTGGAAGCATCAAGAAGATGAACTTTGTGGAAGGTGGTCCAATAAAGTATTTGAAGCACAAGCTTCATGTGA TTGACGACAAGAACTTGGTAACCAAATACTCACTAATCGAAGGAGATGTTCTAGGAGACAAATTGGAATCCATTACC TATGATGTTAAATTCGAAACCTCTGCAAAAGGAGGTTGTATTTGCAAGACATCAACTGAGTACCACACAAAAGGTGA TTATGTTTTTAAGGAAGAAGAACATAATGAAGGCAAAGAGAAAGCCATGGAACTTTTCAAGGTTGTTGAAGACTACC TTCTTGCCAATTCTACCGTCTATGCCTAA。
[0014] 优选地，所述引物扩增出的烟草病程相关蛋白PR10基因得到的融合蛋白氨基酸 序列为SEQIDN0. 4所示的氨基酸序列；
[0015] 所述SEQIDN0. 4所示的氨基酸序列如下：
[0016]MGVTTYTHEASTTVAPTRLFKALVLDADNLIPKLMPQVVKNIETVE⑶GGVGSIKKMNFVEGGPIKY LKHKLHVIDDKNLVTKYSLIE⑶VL⑶KLESITYDVKFETSAKGGCICKTSTEYHTK⑶YVFKEEEHNEGKEKAM ELFKVVEDYLLANSTVYA*〇
[0017] 优选地，使用所述PCR扩增引物进行PCR扩增所得到的产物片段无缝克隆到 pColdll载体NdeI和HindIII克隆位点上，得到所需重组质粒。
[0018] 本发明中，所述pColdll表达载体是一个基于低温冷休克蛋白基因的大肠杆菌高 效表达载体，当培养的大肠杆菌的温度充分降低，几乎暂时停止生长大部分的蛋白或表达 减少时，一组被称为"冷休克蛋白"的蛋白质被专门诱导表达，是一个分析蛋白质功能和结 构的重要工具。
[0019] 本发明中，所述无缝克隆相比现有技术的双酶切后连接和TA连接，即省时省力， 还可以在质粒的任何位点进行一个或多个目标DNA片断的插入，而不需要任何限制性内切 酶和连接酶。无缝克隆技术突破了传统的双酶切再加上连接，只需要一步重组法，即可得到 高效率克隆的重组载体。
[0020] 第二方面，本发明提供一种利用如第一方面所述的PCR扩增引物扩增烟草病程相 关蛋白PR10的方法，包括以下步骤：
[0021] (1)以SEQIDN0. 1-2所示的序列为引物，对含有烟草PR10基因序列的 pMD⑧丨8-T载体为模板进行扩增，得到烟草病程相关蛋白PR10的基因片段；
[0022] (2)将步骤（1)扩增得到的基因片段无缝克隆到pColdll载体中，构建重组质粒；
[0023] (3)将重组质粒转化大肠杆菌，得到重组大肠杆菌，然后对重组大肠杆菌低温诱导 表达，表达产物经纯化后得到可溶性的融合蛋白。
[0024] 优选地，步骤（1)所述的模板为从烟草叶片cDNA中克隆得到的PR10基因序列克 隆到pMD? 18-T载体得到的质粒。
[0025] 优选地，步骤⑴所述的扩增条件为：
[0026] (a)95°C预变性 3min，1 循环；
[0027] (b) 95°C变性 30s、57°C退火 30s、72°C延伸 60s，35 个循环；
[0028] (c)72°C延伸lOmin，1 循环；
[0029] (d)4°C保存。
[0030] 优选地，步骤（2)所述将步骤（1)扩增得到的基因片段无缝克隆到pColdll载体 的NdeI和HindIII克隆位点。
[0031] 优选地，步骤（3)所述的低温诱导表达包括如下步骤：37°C下培养至0D6。。为 0. 5-0. 6时，加入四环素在37°C下培养30-35min，冷却，加IPTG低温诱导过夜，离心收菌。
[0032]所述0D6。。为0·5-0. 6,例如可以是0·51、0· 52、0· 53、0· 54、0· 55、0· 56、0· 57、0· 58、 0· 59 或 0· 6。
[0033]所述培养时间 30_35min，例如可以是 30min、31min、32min、33min、34min或 35min。
[0034] 优选地，所述四环素的浓度为9-10ng/mL，例如可以是9ng/mL、9.lng/mL、9. 2ng/ mL、9. 3ng/mL、9. 4ng/mL、9. 5ng/mL、9. 6ng/mL、9. 7ng/mL、9. 8ng/mL、9. 9ng/mL或 10ng/mL， 优选为10ng/mL。
[0035]优选地，所述IPTG的浓度为 0. 08-0. 15mM，例如可以是 0. 08mM、. 0. 09mM、0.ImM、 0·llmM、0. 12mM、0. 13mM、0. 14mM或 0· 15mM，优选为 0· 1-0. 12mM，进一步优选为 0·