一种新型甲型肝炎病毒株及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及病毒领域，具体讲，涉及一种新型甲型肝炎病毒株及其应用。
【背景技术】
[0002] 甲肝病毒属于小RNA病毒科（Picornaviridae)，在1991年甲肝病毒被划分为 h印atovirus属且该属仅包含甲肝病毒一个种；甲型肝炎病毒是一种颗粒较小，在体外为 无包膜状态的球形颗粒，其基因组为单股正链RNA，基因组长度约为7400个核苷酸，主要通 过粪口途径传播，并在肝脏中复制。主要可以感染人和猴，根据基因组分析，目前甲肝病毒 分为6个基因型，其中I、II和III型主要感染人，IV、VandVI主要感染猴子，但甲肝病毒 仅包含一个血清型。甲肝病毒感染的临床症状主要表现为疲乏，食欲减退，肝肿大，肝功能 异常，部分病例出现黄疸，主要表现为急性肝炎，无症状感染者常见。任何年龄均可患本病， 但主要为儿童和青少年。成人甲肝的临床症状一般较儿童为重。
[0003] 甲型肝炎病毒常引起急性的肝炎，我国是甲型肝炎的高发区之一，其发病为各型 肝炎的首位，甲肝病毒有时也引起暴发。该病毒在体外较稳定，耐热且耐酸性条件，因此的 体外传播的风险和时间也大大增加。甲肝病毒感染期较长，多数感染者病程在15-45天，平 均病程也长达30天，由于该病的高发病率及较长的病程，给人民健康及经济发展带来严重 影响。甲肝病毒感染目前仍无有效的治疗药物，接种疫苗是目前人类对抗甲肝病毒的主要 手段和最经济的措施。迄今为止，甲肝病毒仅在人类、灵长类动物中发现，未在其他动物中 发现有甲肝病毒的存在。但是目前我国采用的甲肝疫苗为减毒疫苗，存在毒力返祖和次传 播问题，对接种者及其密切接触者构成潜在的安全隐患。其次，对免疫功能低下或缺陷者高 度危险。此外，减毒活疫苗还存在热稳定性差、运输贮存条件要求苛刻等缺点。
[0004] 然而，目前对于各种类型甲型肝炎病毒的基因组还了解甚少。对于新型甲型肝炎 病毒的发现并对其基因组特征和病毒特性的解析对于诊断、治疗或预防人类甲肝将有很大 益处。
【发明内容】
[0005] 本发明的首要发明目的在于提出了一种新的型别的甲型肝炎病毒株，此病毒株多 聚蛋白区与已知人甲肝病毒氨基酸同源性为67%，同时可以定义为新的甲肝病毒血清型， 该病毒株的保藏编号为CGMCCN0. 11200。该甲型肝炎病毒株的全基因序列如SEQIDN0: 1所示。
[0006] 本发明的第二发明目的在于提出该甲型肝炎病毒株在制备用于预防和/或治疗 甲型肝炎的药物中的应用。其中，药物选自甲肝减毒活疫苗、甲肝灭活疫苗、甲肝多肽疫苗 或甲肝基因工程疫苗，所述的甲肝灭活疫苗包括亚单位疫苗。
[0007] 本发明的第三发明目的在于提出一种甲型肝炎的疫苗，该疫苗中含有本发明的甲 型肝炎病毒株；所述的疫苗优选为甲肝减毒活疫苗、甲肝灭活疫苗、甲肝多肽疫苗或甲肝基 因工程疫苗，所述的甲肝灭活疫苗包括亚单位疫苗。
[0008] 本发明的第四发明目的在于提出一种用于制备抗体、杂交瘤细胞或抗血清的方 法，根据本发明的病毒株、该病毒株的裂解成份、该病毒株的基因工程蛋白或该病毒株的多 肽为免疫原进行制备。
[0009] 本发明的第五发明目的在于提出采用上述方法得到的制备抗体、杂交瘤细胞或抗 血清。
[0010] 本发明的第六发明目的在于提出该甲型肝炎病毒株在制备甲肝诊断制剂中的应 用。
[0011] 其中：诊断制剂包括抗原检测试剂盒、抗体检测试剂盒和核酸检测试剂盒；抗原 检测试剂盒中的抗原选自甲肝病毒、病毒株的裂解成份、病毒株的基因工程蛋白或病毒株 的多肽；；抗体检测试剂盒中的抗体选自甲肝病毒、病毒株的裂解成份、病毒株的基因工程 蛋白或病毒株的多肽制备的单抗或多抗；核酸检测试剂盒包括普通PCR和实时荧光PCR等。
[0012] 下面对本发明的技术方案做进一步的解释和说明。
[0013] 本发明涉及一种全新的甲型肝炎病毒株，其保藏号为CGMCCN0. 11200 ;通过对甲 型肝炎病毒基因组进行全序列的测定，全基因组长7581bp，其序列如SEQIDN0 :1所示。最 后进行病毒序列的全基因组扩增。本发明为检测甲型肝炎病毒、研究甲型肝炎病毒感染机 制等目的奠定可靠的基础。
[0014] 该甲型肝炎病毒株的分离和纯化方法为：取带毒动物的粪便加入到离心管中，加 入缓冲溶液震荡后离心，粗纯化病毒悬液；采用荧光定量PCR检测病毒中甲型肝炎的RNA 载量；利用蔗糖/甘油密度离心收集甘油和30%蔗糖密度的样品，脱糖后作为纯化后抗原； 本发明采用土拨鼠粪便进行病毒的分离培养，利用real-time实时定量初步鉴定为甲肝病 毒，RT-PCR技术奖病毒的VP1区进行基因扩增后测序，经Genbank比对结果表明，该病毒为 甲型肝炎病毒一个新的型别。
[0015] 本发明的基因组全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法和RACE方法获得。
[0016] 本发明涉及该甲型肝炎病毒株在制备用于预防和/或治疗甲型肝炎的药物中的 应用。其中，药物选自甲肝减毒活疫苗、甲肝灭活疫苗、甲肝多肽疫苗或甲肝基因工程疫苗。 其中减毒活疫苗、灭活疫苗、多肽疫苗或基因工程疫苗的制备可采用现有技术的方法进行 制备。这些技术在下列文献中有全面的描述：《动物基因工程疫苗原理与方法》，《疫苗学》 (StanleyA.Plotkin和WaalterA编，梁晓峰等译，2011)《疫苗研究与应用》（赵铠编著， 2013年），《疫苗关键技术详解》第二版（李琦涵著）。
[0017] 本发明还涉及制备抗体、杂交瘤细胞或抗血清的方法，具体可采用本发明的病毒 株、该病毒株的裂解成份、该病毒株的基因工程蛋白或该病毒株的多肽为免疫原按照现有 技术的方法进行制备。
[0018] 本发明的另一发明目的在于提出该甲型肝炎病毒株在制备甲肝诊断制剂中的应 用。诊断试剂盒的设计和制备可采用现有技术中的方法进行制备。对于PCR扩增法，可根据 本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并按本领域技术人 员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。在获得线全长序列后， 根据初步全长序列设计引物，扩增2000~3000bp的长片段，以保证全长序列准确性。
[0019] 本发明的病毒株，可感染美洲旱獭，lX107C〇pieS/ml的病毒量能够引起1-3美洲 旱獭的发病或死亡。
【附图说明】：
[0020] 图1为病毒接种于单层FRhK4细胞后的增殖变化图；
[0021] 图2为免疫电镜结果图；
[0022] 图3为对动物攻毒后血液中转氨酶含量变化图；
[0023] 图4为荧光定量PCR检测份粪便中HAVRNA载量的结果图；
[0024] 图5为肝脏病理分析结果，图A攻毒后旱獭肝脏病理分析结果，肝脏出现了细胞颗 粒样变性；图B为正常未攻毒旱獭肝脏病理分析结果。
[0025] 保藏说明：
[0026] 本发明中的甲型肝炎病毒株保藏编号为CGMCCN0. 11200,分类命名为！fepatitis Avirus。保藏单位：中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰 西路1号院3号，保藏日期：2015年9月29日。
[0027] 本发明的【具体实施方式】仅限于进一步解释和说明本发明，并不对本发明的内容构 成限制。
【具体实施方式】 [0028] 实施例1
[0029] 病毒的分离和纯化：
[0030] 1.取2g粪便加入到离心管中，10mlPBS(+)(含终浓度为100U/ml的青霉素、 100ug/ml的链霉素）在震荡器上强力震荡20分钟。
[0031] 2. 4°C、8000RPM离心20分钟，取上清作为粗纯化病毒悬液。
[0032] 3.采用荧光定量PCR(探针法）检测粪便病毒悬液中新型HAVRNA载量：所述的 荧光定量PCR
[0033] 3.蔗糖梯度离心
[0034] 利用蔗糖/甘油密度离心，38000rpm，离心6小时，收集甘油和30%蔗糖密度的样 品，脱糖后作为纯化后抗原。
[0035] 4.病毒序列的全基因组扩增：
[0036] 在通过高通量测序获得部分新型甲肝病毒序列的基础上，通过Genomewalking Kit获得6000bp的基因组，然后采用SMARTERRACEcDNAAmplificationKit扩增 3' 末端 和5末端的获得全基因组序列，在此基础上设计引物对全基因组进行长片段的验证，保证 序列的准确性。
[0037] 经检验，其全基因序列如SEQIDN0:1所示。
[0038] 5.病毒的分离培养：上述粗纯化病毒接种于单层FRhK4细胞，接种后每天收集 200微升细胞上清，培养到28天，用定量PCR检测细胞上清中病毒，细胞虽为出现明显CPE， 但细胞在培养过程中有增殖。病毒增殖含量变化图如图1所示。
[0039] 实施例2 :本发明的甲型肝炎病毒免疫小鼠制备抗血清及评价
[0040] 实验动物：Balb/c小鼠，6周龄，共8只；
[0041] 将实施例1提纯后定量的病毒皮下注射8只，首次剂量分别为1.0X105C〇pieS、 2. 5X104copies、1. 0X104copies、5. 0X103copies、1. 0X103copies、5. 0X102copies、 1. 5X102c〇pies/ml，每个剂量免疫1只小鼠（加相同体积弗氏完全佐剂），1只作为对照组， 两周后剂量减半加强免疫一次（此时的佐剂为弗氏不完全佐剂），每只小鼠注射体积为100 微升纯化病毒加100微升佐剂，采用多点注射方式。以PBS免疫组为对照，21天眼球采血， 收集血清备用；
[0042] 采用ELISA方法：将蔗糖/甘油纯化病毒作为抗原包被96孔板，以小鼠免疫血清 作为一抗将蔗糖/甘油纯化病毒作为抗原用包被液（20mMNaHC03pH9.0)稀释，37°C包被 2h，PBS-T洗板3次，每孔加入200μ1 5%脱脂奶粉，37°C封闭lh，待检测血清1:200稀释后 加入包被好的板子，37°Clh;PBS-T洗3次，加入100μ1兔抗旱獭IgG(1:3000) 37°C，30min; PBS-T洗3次，TMB显色lOmin;加入终止液50μ1终止反应，将酶标板置于酶标仪中，450nm 波长测定吸光度；测定结果如表2所示：
[0043] 表2 :小鼠多克隆抗体制备
[0044]
[0045] 实施例3 :本发明的甲型肝炎病毒的免疫电镜
[0046] 1.将纯化病毒材料0. 9m