一种假单胞菌菌株及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物领域，涉及一种假单胞菌菌株，特别涉及一种假单胞菌菌株及 其应用。
【背景技术】
[0002] 嗜水气单胞菌（Aeromonashydrophila)和温和气单胞菌（Aeromonassobria)存 在于养殖水环境中，常引起几乎所有淡水养殖鱼类患出血性败血症，发病率高，死亡率也很 高，给水产养殖业造成重大经济损失。过去防治该病主要采用投喂抗生素，外用消毒剂杀灭 水体中的病原菌，长期如此不仅会产生药物残留、诱导耐药病原菌产生和污染水环境，而且 消毒剂无选择性杀灭水中有益菌，破坏了水体微生态平衡，为后续爆发细菌性败血症埋下 了隐患。
[0003] 由于引起鱼类患出血性败血症的病原菌（嗜水气单胞菌和温和气单胞菌）来自养 殖水体，所以，需要在不影响有益菌的情况下专一杀灭水环境中的嗜水气单胞菌和温和气 单胞菌，消除养殖鱼类的病原来源，预防出血性败血症发生。这是解决上述问题的有效途 径。
【发明内容】
[0004] 为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种假单胞菌菌 株。该菌株的发酵液中的活性物质具有专一"性抑制嗜水气单胞菌（Aeromonashydrophila) 和温和气单胞菌（Aeromonassobria)的作用，对水环境中分离的其它菌无不良影响，正好 解决了现有技术中的问题。该假单胞菌菌株可开发成微生态制剂控制养殖环境中的病原温 和气单胞菌和嗜水气单胞菌，预防其感染鱼类引起出血性败血症。
[0005] 本发明的另一目的在于提供上述假单胞菌菌株的应用。
[0006] 本发明的目的通过下述技术方案实现：
[0007] 为实现上述目的，本发明提供一种假单胞菌，菌种命名为Pseudomonasprotegens IAS03,是从池塘底泥分离纯化获得的。
[0008] 所述的假单胞菌（Pseudomonasprotegens)IAS03的保藏信息：保藏单位：中国典 型培养物保藏中心（CCTCC)，保藏日期：2015年11月27日，保藏地址：中国.武汉.武汉大 学，保藏编号：CCTCCΝ0:Μ2015711。
[0009] 所述的假单胞菌（Pseudomonasprotegens)IAS03菌株的液体培养基为牛肉膏蛋 白胨液体培养基，牛肉膏蛋白胨固体培养基则在液体培养基配方基础上，每l〇〇〇ml液体培 养基中加入琼脂15~20g加热融化制成。
[0010] 所述的牛肉膏蛋白胨液体培养基：蛋白胨10g/L、牛肉膏3g/L、氯化钠5g/L、琼脂 15~20g/L，pH7. 0~7. 2,121°C、20min高温灭菌处理；牛肉膏蛋白胨液体培养基不加琼脂 即可。
[0011] 所述的假单胞菌（Pseudomonasprotegens)IAS03菌株的发酵培养基为LB培养 基，其组分为：蛋白胨l〇g/L、酵母提取粉5g/L、氯化钠10g/L，pH值7. 0~7. 2,121°C、20min 高温灭菌处理。
[0012] 本发明提供的假单胞菌（Pseudomonasprotegens)IAS03菌株应用于抑制嗜水气 单胞菌和/或温和气单胞菌。
[0013] 所述的假单胞菌（Pseudomonasprotegens)IAS03在预防嗜水气单胞菌和/或温 和气单胞菌感染中的应用。
[0014] 所述的假单胞菌（Pseudomonasprotegens)IAS03在制备抑制嗜水气单胞菌和/ 或温和气单胞菌的产品中的应用。
[0015] 所述的假单胞菌（Pseudomonasprotegens)IAS03菌株抑制嗜水气单胞菌和温和 气单胞菌的原理在于假单胞菌属既能通过营养竞争抑制病原菌的生长，还能产生嗜铁素、 氢氰酸、卵菌素、吩嗪-1-羧酸和藤黄菌素等具有抑菌作用的次级代谢产物和抗菌多肽，专 一抑杀病原菌，而对其他菌或者藻类不造成伤害，从而保证了在不破坏水体生态系统平衡 的前提下，从源头上杀灭病原菌。
[0016] 本发明相对于现有技术，具有如下的优点及效果：
[0017] (1)本发明提供了假单胞菌（Pseudomonasprotegens)IAS03 菌株。
[0018] (2)本发明的假单胞菌（Pseudomonasprotegens)IAS03菌株从池塘底泥筛选得 至IJ，再用回水体不存在生态安全风险，符合生物安全法规。
[0019] (3)本发明的假单胞菌IAS03菌株能够有效抑制水产病原菌：嗜水气单胞菌和/ 或温和气单胞菌。
[0020] (4)本发明的假单胞菌IAS03菌株对嗜水气单胞菌和温和气单胞菌产生抑菌效 果，而对其他细菌无抑制效果，具有专一性的抑菌作用，而且该菌对鱼无致病性。
[0021] (5)本发明的假单胞菌IAS03菌株仅须单一菌株即可应用于抑制嗜水气单胞菌和 /或温和气单胞菌，相对于传统的抗生素和消毒剂防治措施，具有安全、绿色、高效的优点。
【附图说明】
[0022] 图1是假单胞菌IAS03菌株的菌液对嗜水气单胞菌和温和气单胞菌的抑制效果； 其中，图1A为假单胞菌IAS03菌株的菌液对嗜水气单胞菌的抑制效果；图1B为假单胞菌 IAS03菌株的菌液对温和气单胞菌的抑制效果。
[0023] 图2是假单胞菌IAS03菌株的无菌发酵液10倍浓缩液对嗜水气单胞菌和温和气 单胞菌的抑制效果；其中，图2A为假单胞菌IAS03菌株的无菌发酵液10倍浓缩液对温和气 单胞菌的抑制效果；图2B为假单胞菌IAS03菌株的无菌发酵液10倍浓缩液对嗜水气单胞 菌的抑制效果。
[0024] 图3是假单胞菌IAS03菌株在PDA培养基上的菌落生长情况和在KB固体培养基 上的荧光现象；其中，图3A为假单胞菌IAS03菌株在PDA固体培养基上的培养结果；图3B 为假单胞菌IAS03菌株在KB固体培养基上的培养结果，在302nm的紫外灯下观察到蓝色荧 光。
[0025] 图4是假单胞菌IAS03菌株16SrDNAPCR扩增凝胶电泳图；其中，泳道Μ为DNA markerDL2000 ;泳道1~6为扩增的假单胞菌IAS03菌株16SrDNA条带。
[0026] 图5是10ppm假单胞菌IAS03发酵液对嗜水气单胞菌与温和气单胞菌的抑制效 果；其中，图5A为嗜水气单胞菌；图5B为温和气单胞菌。
[0027] 图6是15ppm假单胞菌IAS03发酵液对嗜水气单胞菌与温和气单胞菌的抑制效 果；其中，图6A为嗜水气单胞菌；图6B为温和气单胞菌。
[0028] 图7是20ppm假单胞菌IAS03发酵液对嗜水气单胞菌与温和气单胞菌的抑制效 果；其中，图7A为嗜水气单胞菌；图7B为温和气单胞菌。
[0029] 图8是25ppm假单胞菌IAS03发酵液对嗜水气单胞菌与温和气单胞菌的抑制效 果；其中，图8A为嗜水气单胞菌；图8B为温和气单胞菌。
[0030] 图9是30ppm假单胞菌IAS03发酵液对嗜水气单胞菌与温和气单胞菌的抑制效 果；其中，图9A为嗜水气单胞菌；图9B为温和气单胞菌。
[0031] 注：*表示加入假单胞菌IAS03发酵液的组（试验组）的嗜水气单胞菌或温和气 单胞菌的量显著低于对照组（P〈〇. 05)，不同小写字母表示试验组不同时间点嗜水气单胞菌 或温和气单胞菌的量间存在显著差异（P〈〇. 05)，而相同字母表示无显著差异。
【具体实施方式】
[0032] 下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细描述，但本发明的实施方式不限于 此。
[0033] 实施例中所述的温和气单胞菌（Aeromonassobria)在文献"灭活菌苗免疫的中华 倒刺鈀外周血免疫指标的变化[J].水产学报，2010, 04:626-634. "中公开。
[0034] 嗜水气单胞菌（Aeromonashydrophila)在文献"42种中草药对嗜水气单胞菌的 体外抑菌试验[J].淡水渔业，2011，03:61-65. "中公开。
[0035] 所述的假单胞菌（Pseudomonasprotegens)IAS03的保藏信息：保藏单位：中国典 型培养物保藏中心（CCTCC)，保藏日期：2015年11月27日，保藏地址：中国.武汉.武汉大 学，保藏编号：CCTCCΝ0:Μ2015711。
[0036] 实施例1
[0037] 所述的假单胞菌（Pseudomonasprotegens)IAS03的筛选与鉴定方法，步骤如下：
[0038] (1)称取来自广州市某池塘的底泥10g于三角烧瓶中，加90mL灭菌水，28°C， 160r/min，恒温摇床振荡30min，静置5min后取上清，采用梯度稀释法将上清稀释103倍， 取0. 15mL稀释液于牛肉膏蛋白胨固体培养基平板均匀涂布，28°C恒温培养16h。牛肉膏蛋 白胨固体培养基：蛋白胨l〇g、牛肉膏3g、氯化钠5g、琼脂15~20g、加水至1000mL、pH7. 0， 121°C、20min高温灭菌处理。相同配方的液体培养基不加琼脂。
[0039] (2)挑取步骤⑴中平板上的单菌落于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，28°C，160r/ min，恒温摇床振荡8h，待0D6。。达到0. 8时，吸取10μL的菌液，通过梯度稀释10 4倍，取 0.lmL于牛肉膏蛋白胨固体培养基平板均匀涂布，28°C恒温培养16h，观察菌落是否单一， 重复3次，并做好标记。
[0040](3)将单一的菌落接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，28°C，160r/min，恒温摇床 振荡8h，作为种子液，按照2% (v/v)的比例接种于装有50mL牛肉膏蛋白胨液体培养基的 250mL的三角烧瓶，在28°C下1