副肿瘤性天疱疮的抗原evpl-n1及其应用【
技术领域：
】[0001]本发明涉及生物
技术领域：
，尤其涉及副肿瘤性天疱疮的抗原EVPL-N1及其应用。【
背景技术：
】[0002]副肿瘤性天疱疮是一种自身免疫性大疱性皮肤病，包斑蛋白和周斑蛋白是患者血清中抗体识别率最高的主要抗原。筛选出其抗原表位有利于临床上建立高敏感度及特异度的诊断方法，同时有利于科研上进一步深入研究其发病机制。副肿瘤性天疱疮伴发多种淋巴系统来源肿瘤，国外报道半数以上为非霍奇金淋巴瘤，而我国与国外伴发的肿瘤谱明显不同，伴有Castleman病的副肿瘤性天疱疮患者占多数，因此筛选并找到副肿瘤性天疱疮中国患者独特的抗原表位对我国患者的诊治和预后具有重大的临床意义。【
发明内容】[0003]本发明的一个目的是提供副肿瘤性天疱疮的抗原EVPL-N1。[0004]本发明提供了一种蛋白质，命名为EVPL-N1，是如下a)或b)或c)的蛋白质：[0005]a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；[0006]b)由序列表中序列2第6-146位所示的氨基酸序列组成的蛋白质；[0007]c)将a)或b)所示的序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由（a)衍生的蛋白质。[0008]上述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。[0009]编码上述蛋白质的DNA分子也是本发明保护范围。[0010]上述DNA分子为如下1)-4)中任一种DNA分子：[0011]1)编码区为序列表中序列1所示的DNA分子；[0012]2)编码区为在序列表中序列1第16-438位所示的DNA分子；[0013]3)与1)或2)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且编码上述蛋白质的DNA分子；[0014]4)在严格条件下与1)或2)或3)限定的DNA序列杂交且编码上述蛋白质的DNA分子。[0015]上述严格条件可为在6XSSC，0.5%SDS的溶液中，在65°C下杂交，然后用2XSSC，0·1%SDS和1XSSC，0·1%SDS各洗膜一次。[0016]上述蛋白质或上述DNA分子在制备诊断或辅助诊断待测人是否患有副肿瘤性天疱疮产品中的应用也是本发明保护的范围。[0017]本发明的另一个目的是提供一种诊断或辅助诊断待测人是否患有副肿瘤性天疱疮的试剂盒。[0018]本发明提供的试剂盒，包括抗原，所述抗原为序列2第6-146位所示的蛋白与标签连接后的融合蛋白。[0019]所述抗原为序列2;[0020]所述试剂盒还包括抗所述标签的抗体和二抗；[0021]上述试剂盒为间接酶联免疫试剂盒。[0022]抗所述标签的抗体为鼠源抗his标签抗体；[0023]二抗为碱性磷酸酶标记的山羊抗人IgG。[0024]上述的试剂盒在制备诊断或辅助诊断待测人是否患有副肿瘤性天疱疮产品中的应用也是本发明保护的范围。[0025]本发明的实验证明，采用重组EVPL-N1作为检测抗原，酶联免疫吸附实验对66例副肿瘤性天疱疮患者和50例正常志愿者血清样本进行检测敏感度74.2%(49/66)，特异性98%。因此，证明重组EVPL-N1是副肿瘤性天疱疮主要表位并可辅助诊断。【附图说明】[0026]图1为包斑蛋白的模式图及EVPL-N1的位置。[0027]图2为纯化后的EVPL-N1重组蛋白与His标签抗体行免疫印迹鉴定结果。[0028]图3为EVPL-N1的R0C曲线分析后结果。【具体实施方式】[0029]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。[0030]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。[0031]pH值为9.6浓度为0.05M的碳酸盐缓冲液（CBS):1.59g碳酸钠（北京化工厂S0148)和2.93g碳酸氢钠（北京化工厂S0037)，溶于1L去离子水（millipore水机自制），0·45um滤器（milliporeSLHV033RB)过滤，调节pH值，得到pH值为9.6浓度为0·05M的CBS〇[0032]pH值为7.5浓度为0·02M的PBST:将PBS粉剂（北京中杉金桥生物公司ZLI-9062)和Tween20(Amresco0777)溶于2L去离子水，PBS粉剂的浓度0.02M，Tween20的体积百分含量为〇.05%，调节pH值，得到pH值为7.5浓度为0.02M的PBST。[0033]封闭液：将脱脂奶粉加入上述pH值为7.5浓度为0.02M的PBST中得到的溶液，使脱脂奶粉的质量百分含量为5%。[0034]实施例1、原核表达EVPL-N1[0035]一、EVPL-N1的筛选[0036]针对包斑蛋白（Envoplakin，EVPL)的N端1-481氨基酸序列区设计了4个相互重叠十多个氨基酸的片段。借助DNAstar软件，综合考虑抗原性（Hydrophilicity)、可及性(Accessibility)、亲水性（Antigenicity)后，将其分为4段，分别是EVPL-N1(aal_aal41)，EVPL-N2(aa95-aa242)，EVPL-N3(aa213-aa377)，EVPL-N4(aa315-aa483);见图1。[0037]其中，EVPL-N1蛋白的氨基酸序列为序列2第6-146位氨基酸，其编码基因的核苷酸序列为序列1第16-438位核苷酸；[0038]EVPL-N2蛋白的氨基酸序列为序列4第6-153位氨基酸，其编码基因的核苷酸序列为序列3第16-459位核苷酸；[0039]EVPL-N3蛋白的氨基酸序列为序列6第6-170位氨基酸，其编码基因的核苷酸序列为序列5第16-510位核苷酸；[0040]EVPL-N4蛋白的氨基酸序列为序列8第6-172位氨基酸，其编码基因的核苷酸序列为序列7第16-516位核苷酸。[0041]二、原核表达EVPL-N1[0042]1、重组载体的构建[0043]将序列表中序列1第16-438位核苷酸的EVPL-N1蛋白编码基因插入pEASY-E2表达载体（全式金生物有限公司CE201-01)进行平端连接，得到的重组载体，命名为PEASY-E2-EVPL-N1，实现EVPL-N1蛋白与载体上的ATGGGAATTGGCCCT和his标签共表达，得到重组EVPL-N1蛋白。[0044]重组EVPL-N1的氨基酸序列为序列2,第1-5位为载体上的MGIGP，第6-146位为EVPL-N1蛋白，第147-158位为his标签。[0045]重组EVPL-N1的编码基因的核苷酸序列为序列1，第1-15位为载体上的ATGGGAATTGGCCCT编码核酸，第16-438位为EVPL-N1蛋白编码基因，第439-477位为his标签编码基因。[0046]2、重组克隆感受态的构建[0047]将重组载体pEASY-E2-EVPL-Nl导入大肠杆菌Transl-Tl(全式金生物有限公司CD5010-01)中，得到重组菌Transl-Tl-EVPL-Nl〇[0048]提取重组菌的质粒送去测序，质粒为pEASY-E2-EVPL-Nl的为阳性重组质粒。[0049]3、重组EVPL-N1蛋白表达[0050]将上述的阳性重组质粒转化至表达感受态细胞Transetta(DE3)ChemicallyCompetentCell(全式金生物有限公司⑶801-01)，，在固态LB上挑取单克隆后摇菌，分装冻存。复苏表达感受态细胞，过夜培养后1:50接种至液态LB，37°C，200rpm/min，摇至0D600=0·6,加入终浓度0·05mM的诱导剂IPTG(Isopropyl_0-D-thiogalactopyranoside,全式金生物有限公司6?101-01)，37°(：，200印111/1^11，诱导5小时。4°(：，10000印111离心101^11收集菌体，并重悬至含蛋白酶抑制剂（rocheCompletetabletsEDTA_free，EASYpack04693132001)的结合缓冲液（50mMNaH2P04,300mMNaCl，PH8.0)中，得到菌体悬浮液。[0051]4、纯化重组EVPL-N1蛋白[0052]菌体悬浮液用超声破碎仪裂解（300W功率，超声5s停10s，持续20min)菌体，4°C，14000g，20min离心，取上清0.45um滤器过滤，加入咪唑，使其终浓度为10mM/L，使用镍柱亲和层析技术纯化，将准备好上清加入镍柱（Ni-NTAHisBindResins默克公司70666-3,流速lml/min)4°C，lOOrprn，摇1小时，含20mM咪唑的漂洗缓冲液（50mMNaH2P04,300mMNaCl，PH8.0,20mM咪唑）漂洗，250mM咪唑的洗脱缓冲液（50mMNaH2P04,300mMNaCl，PH8.0，250mM咪唑）洗脱目的蛋白。[0053]收集2倍柱体积的洗脱液即为分子质量为18.0KD重组EVPL-N1蛋白。[0054]将重组EVPL-N1蛋白进行SDS-PAGE电泳（图2)，目的蛋白EVPL-N1的分子质量为18.0KD;结合缓冲液100倍EVPL-N1蛋白体积，4°C条件当前第1页1 2