一种猪伪狂犬病毒的检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于家畜疾病诊断技术领域，具体涉及一种猪伪狂犬病毒检测方法。
【背景技术】
[0002] 猪伪狂犬病（PseudorabiesPR)是由猪伪狂犬病病毒（PseudorabiesvirusPRV) 引起的猪、牛、羊等多种家畜及野生动物的一种高度接触性、急性传染病。猪是PR主要的 天然宿主和最主要的传染源。各年龄阶段的猪只均可被感染，该病在猪群多呈暴发性流 行，给我国乃至全球的养猪业带来了巨大的经济损失。目前，主要依靠接种gE基因缺失的 Bartha-K61弱毒疫苗来预防本病。但是2011年以来我国多省份出现了新的毒力更强变异 毒株，造成了很大的经济损失，即使接种的猪只也不能幸免于难，出现了不同年龄段猪的死 亡。表明Bartha-K61弱毒疫苗已经不能提供完全的保护力。
[0003] 而且，由于病毒基因组很容易发生变异，导致已有的用于检测的抗体失去效果，这 就加大了对于PRV进行正确诊断的困难，因此迫切需要建立一种特异性高的PRV进行鉴别 诊断的方法，从而为PR正确诊断提供科学的手段。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种猪伪狂犬病毒的检测方法，用本发明制备的针对PRV gE 蛋白的高特异性单克隆抗体，基于该单抗建立的阻断ELISA方法具有特异性高、灵敏度强、 无假阳检测的特点，从而为PR准确诊断提供科学的依据。
[0005] 本发明首先提供一种具有新的具有良好免疫原性的gE蛋白，较以前报道的PRV的 gE蛋白，在第48位和第492~496位各有1个天冬氨酸的插入，该区域恰好处于gE蛋白抗 原表位所处的结构域中，氨基酸的插入很可能改变了已知毒株存在的抗原表位，造成其致 病性增强，其氨基酸序列为SEQ ID NO: 1 ;
[0006] 编码上述gE蛋白的基因，其一种核苷酸序列为SEQ ID NO: 2;
[0007] 上述的gE蛋白作为抗原用于制备抗体；
[0008] 本发明再一个方面提供一种检测患病猪群抗体的阻断ELISA方法，包括如下的具 体步骤：
[0009] 将gE蛋白抗原经过稀释液稀释，定量包被在ELISA 96孔板中，4°C过夜；
[0010] 用PBST洗涤液对未结合的抗原进行清洗；
[0011] 分别将阴性血清、阳性血清和待检血清加到相应的检测孔中，轻微震动，使反应板 中的液体混匀；
[0012] 将微量反应板密封后置于37°C孵育；
[0013] 垂直倒掉反应板中的液体，并用洗涤液进行对每个孔进行清洗；
[0014] 用封闭液对反应板进行封闭，置于37°C孵育；
[0015] 去除反应板中的液体，并用洗涤液进行对每个孔进行清洗；
[0016] 将稀释好的酶标单抗加入到每个反应孔中，置于37°C孵育；
[0017] 倒掉反应板中的液体，并用洗涤液进行对每个孔进行清洗；
[0018] 添加底物，置于37 °C中反应；
[0019] 加入终止液，终止反应，并于酶标仪读取450nm吸光度值，样品值/阴性值大于2 判定为阳性，小于1为阴性。
[0020] 其中阴性血清的制备方法为：未经免疫小鼠血清为阴性血清；
[0021 ] 阳性血清是gE蛋白免疫小鼠的分离血清。
[0022] 所述的封闭液为：5%脱脂奶粉
[0023] 洗涤液为：含0·5%。吐温-20的PBS溶液；
[0024] 所使用的酶标单抗，其制备方法为：
[0025] 将用于酶标的单克隆抗体进行纯化后，对单克隆抗体进行辣根过氧化物酶（HRP) 进行酶标，具体步骤如下：
[0026] 称取5mg HRP溶于0· 5ml蒸馏水中；
[0027] 加入0· 5ml0· 06MNaI04,4°C轻摇30min，溶液呈现黄绿色；
[0028] 加入0. 5ml0. 16M乙二醇，室温下避光轻摇30min，终止氧化反应；
[0029] 加入5mg抗体，装入透析袋中，置于0· 05M，pH为9. 6的碳酸盐缓冲液（CBS)中， 4°C透析过夜，期间更换至少3次CBS;
[0030] 取出透析袋中的液体，加入5mg/mlNaHB40. 2ml，4°C过夜；
[0031] 加入等体积饱和硫酸铵溶液沉淀结合物，4°C30min后，3000rpm离心15min，丢弃 上清；
[0032] 将沉淀物溶于PBS中，装入透析袋中，并以PBS为缓冲液透析6-12h，更换3次透析 液；
[0033] 最后，将获得的液体-20 °C分装保存。
[0034] 终止液为：2MH2S04。制备方法是蒸馏水178. 3ml，逐滴加入浓硫酸21. 7ml。
[0035] 本发明的通过制备具有特异性高的单克隆抗体，并建立基于该单克隆抗体检测PR 毒株的方法，从而对目前流行的PR毒株具有良好的鉴别诊断的作用。
【具体实施方式】
[0036] 下面结合具体实施例来进一步对本发明进项详细描述，本领域的普通技术人员在 本发明技术方案的基础上，可以选用本领域常用的方法步骤，而不仅限于本发明说明书实 施例的具体记载。
[0037] 实施例1 :PRV主要抗原gE基因质粒的克隆、转化以及表达载体的构建
[0038] 采用生物信息学方法，并结合相关的文献报道，本发明选取了gE基因包含主要抗 原位点膜外区域lbp~1275bp共计1275bp的基因序列进行扩增，扩增采用的模版DNA为 本实验室经过前期优选并送往菌种包藏中心编号为CGMCCNo. 10266毒株。
[0039] PCR扩增后得到1275bp的目的片段，并将其与pMD-19T载体连接，测序正确后，经 过BamHI和Xhol双酶切后，胶回收后将其连接到经过相同酶切的pGEX-6p-l表达载体上， 测序正确后命名为pGEX-gE进行菌种保存，并用于下游实验。对质粒进行测序得到目的片 段的核苷酸序列为SEQ IDN0:1，编码的氨基酸序列为SEQ IDN0:2;
[0040] 对新分离的gE核苷酸序列进行比对其与以前分离的毒株的亲缘关系相对较远。 gE基因第48位和第492~496位各有1个天冬氨酸的插入。而以前分离到的毒株只个别 有一个位置插入氨基酸，绝大部分没有插入。这很可能是现有疫苗不能提供完全保护的原 因所在。
[0041] 表1 :扩增中用到的引物
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[0043] 实施例2 :gE基因的原核蛋白表达、分析与纯化
[0044] 将重组质粒pGEX-gE转化表达感受态BL21 (DE3)，挑取K+LB平板上的白色单菌落， 接种于5ml含A+的LB培养液中37°C过夜培养。次日，将菌液按1 :100比例接种于含K+的 LB培养液中，37°C摇床振荡培养至0D_Ji到0. 4~0. 6时，并对表达的温度、IPTG诱导浓 度、诱导时间等条件进行摸索以确定蛋白的最优表达条件。将表达的蛋白经过SDS-PAGE表 达情况的分析，并经琼脂糖扩散实验对表达蛋白的抗原性进行分析。大量扩增目的蛋白，并 利用GST蛋白纯化试剂盒对可溶性蛋白进行纯化，并通过BCA试剂盒以及nanodrop2000 对蛋白含量进行测定。
[0045] 实施例3 :单克隆抗体的制备
[0046] L动物免疫
[0047] 以纯化后的原核表达重组蛋白gE为免疫原，免疫4~6周龄雌性Balb/c小鼠。共 免疫3次，每次间隔两周。一免将纯化后的重组蛋白gE蛋白与等体积的弗氏完全佐剂混合 乳化，免疫途径为皮下免疫；第二、三次免疫均将纯化gE与等体积的弗氏不完全佐剂混合 乳化，免疫途径为腹腔免疫。三次免疫剂量均为1〇〇μg/只。细胞融合前3d，对免疫效果好 的Balb/c小鼠腹腔注射100μg纯化gE蛋白（不加佐剂），进行加强免疫。
[0048] 2.PRV纯化
[0049] 将PRV接种Vero细胞，Μ0Ι= 1。37°C温箱孵育，48h~72h后收获细胞。
[0050] 将收获的细胞反复冻融三次后，4°C4OOOrpm离心30min，继而再8OOOrpm离心 60min，弃沉淀。
[0051] 将收集的上清超速离心，4°C25OOOrpm离心lh30min，弃上清。
[0052] 用适量的PBS溶解沉淀，经20 %、40 %和60 %蔗糖密度梯度4°C30OOOrpm离心 2. 5h，弃上清。
[0053] 再次用适量的PBS溶解沉淀，4°C100 000g离心3h进行脱糖，弃上清。
[0054] 加入适量PBS溶解沉淀，分装保存于_70°C。按BCA方法测其浓度。
[0055] 3.间接ELISA方法的建立
[0056] 将二、三次免疫后7~9d小鼠断尾采血，分离血清。以蔗糖密度梯度纯化的PRV 为抗原、以免疫鼠血清为阳性血清、未免疫鼠血清为阴性血清，建立筛选杂交瘤细胞的间接 ELISA检测方法。具体步骤如下：
[0057] 用CBS缓冲液将纯化后PRV以10μg/ml的浓度开始做2倍梯度稀释，100μ1/孔， 4 °C包被过夜；
[0058] 弃包被液，PBST振荡洗板3次，3min/次，拍干；
[0059] 加含5%脱脂乳的PBS封闭，200μ1/孔，37°C孵育2h后如上述方法洗板；
[0060] 将小鼠阴阳性血清做1:100、1:200、1:400、1:800倍稀释，100μ1/孔，同时设空白 对照。37°C作用lh后洗板；
[0061] 将羊抗鼠HRP-IgG做20 000倍稀释，100μ1/孔，37°C作用45min后洗板；
[0062] 每孔加100μ1TMB显色液，37°C避光显色15min。2MH2S04(50μ1/孔）终止反应 后，于酶标仪测定0D45Qnn/(E〇
[0063] 4.细胞融合
[0064] 1)饲养层细胞的制备
[0065] 细胞融合前ld，将8~12周龄健康未免疫BALB/c小鼠眼球采血致死，分离得到的 血清可作为阴性对照。置75%酒精中浸泡5min，放于生物安全柜固定；
[0066] 用无菌镊子提起其腹部皮肤，小心将此处剪开并顿性剥离，使腹膜充分并完整地 暴露。同时用酒精棉球轻轻擦拭消毒；
[0067] 用一次性无菌注射器吸取5mlDMEM基础培养液注入小鼠腹腔，固定注射器并用酒 精棉球轻轻按摩其腹部l-2min。随后吸出腹腔中的培养液注入HAT培养液中。
[0068] 将细胞混匀后加到96孔细胞培养板中，100μ1/孔。将96孔细胞培养板置于 37°C，5% (：02培养箱中培养。
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