一种异香豆素类化合物及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于植物有效成分提取技术领域，具体设及一种异香豆素类化合物及其制 备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 曲霉属真菌广泛存在于自然界中。其中，米曲霉是一种能产生复合酶的菌株，该 菌株除可产生蛋白酶外，还可产淀粉酶、糖化酶、纤维素酶、植酸酶等多种功能的酶，因而 广泛应用于食品、饲料、酿酒等发酵工业。同时，米曲霉次生代谢产物也被认为是一个亟 待开发的重要资源。从不同来源的米曲霉发酵产物中也分离得到了一系列具有生物活 性的天然产物，包括了生物碱、多肤、祗类化合物W及多酪类化合物。如从海洋生物红藻 化?terosi如(Wia 中分离得到的米曲霉发酵产物中分离得到了一系列新颖的吗I噪 二祗类化合物aspoiyzinsA-C。
【发明内容】
[0003] 本发明W百合科重楼属滨重楼巧如iiavar.jWMa打eftsis)中分离得 到的曲霉属内生真菌米曲霉的固态发酵物为原料，经有机溶剂提取、硅胶柱层析、高压液相 色谱分离得到一类新颖的异香豆素类化合物，值得一提的是，该化合物是从自然界中发现 的第一个具有罕见2-幾基-丙基和3-径基-丙基片段的异香豆素类化合物，同时，该化合 物显示了一定的细胞毒活性和抗烟草花叶病毒活性。
[0004] 本发明的第一目的是提供一种异香豆素类化合物；第二目的在于提供所述异香豆 素类化合物的制备方法；第Ξ目的在于提供所述异香豆素类化合物的应用。
[0005] 本发明的第一目的是运样实现的，所述的异香豆素类化合物是W百合科植物滨重 楼公口妙扣片知var. jwMa打ensis)中得到的曲霉属真菌米曲霉巧知心化· oiyzae)的固体发酵物为原料，经有机溶剂提取、正反相硅胶柱层析富集、高压液相色谱分 离获得，其分子式为CisHieOs，命名为米曲霉素A，英文名为oryzaeinsA，其结构式为：
[0006] 本发明的第二目的是运样实现的，是W百合科植物滨重楼公〇&7^々^7知 var.jWManeftsis)中得到的曲霉属真菌米曲霉知心化· 口巧為36)的固体发酵物为 原料，经有机溶剂提取、正反相硅胶柱层析富集、高压液相色谱分离获得，具体为： A、内生真菌米曲霉的分离：将75%乙醇消毒后的百合科重楼 属滨重楼（化打5公〇妙扣片知var.jWManeftsis)茎杆和/或叶片放入无菌的研鉢中进 行研磨，研磨后转入无菌的塑料管内，1000~3000巧m离屯、2~lOmin，吸取]-100微升上清 液，涂布在化平板上，倒置于培养箱中，25~30摄氏度黑暗培养2~10天，反复挑取单菌落培 养并编号保存菌种，直到获得单一内生真菌菌落，经ITS测序（GenbankAccessionnumber
GGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAAAAGCCGGAGGAA)确定为曲霉属真菌米曲霉 ，其曲霉属真菌米曲霉见附图4 ; B、 内生真菌米曲霉Uwer知心^/6· 菌种培养：A步骤分离得到的米曲霉菌种在 室溫下接种在马铃馨葡萄糖琼脂培养基上，25~30°C培养7~10天，再接种在50~500毫升的 Ξ角瓶中，每个Ξ角瓶含10~100毫升马铃馨葡萄糖培养基，置于25~30摄氏度下震荡培养 5~10天得到液体发酵种子； C、 米曲霉〇4^6'知心^/5oiyzae)的规模化发酵：将B步骤培养得到的的液体发酵种子 进行规模化发酵，规模化发酵是在100~1000个100~500ml的冯己赫瓶中进行，每个瓶含有 10~200g大米和10~200ml蒸馈水，每个瓶中接种1.0~5.0ml步骤B培养得到的液体发酵种 子，于25~30°C培养15~45天得到米曲霉发酵物； D、 浸膏提取：将C步骤发酵得到的米曲霉发酵物用有机溶剂超声提取2~5次，每次 30~60min，合并提取液后过滤提取液，减压浓缩，静置，滤除沉淀物，浓缩得到浸膏a; E、 硅胶柱层析：将D步骤所得的浸膏a用浸膏a重量的1. 5~3倍量的丙酬或者二氯甲 烧溶解，用浸膏a重量的1~1. 5倍量的80~100目硅胶拌样，然后上硅胶柱层析，装柱硅胶为 200~300目，用量为浸膏a重量的6~10倍量；用体积配比为20:1~0:1的混合有机溶剂梯度 洗脱，收集梯度洗脱液、浓缩，经TLC或分析型HPLC监测，合并相同的部分； F、 反相柱层析：将E步骤中W8:2配比的混合有机溶剂进行洗脱得到的洗脱液上反相 柱层析，反相柱是用反相材料C-18装柱；用体积浓度为20~80%的甲醇溶液进行梯度洗脱， 收集各部分洗脱液并浓缩，经TLC监测，合并相同的部分。
[0007]G、高效液相色谱分离：将W体积浓度50~70%甲醇溶液洗脱得到的洗脱液经高效 液相色谱分离纯化，即得所述的异香豆素类化合物米曲霉素A，英文名为oryzaeinsA。
[0008] 本发明制备得到的异香豆素类化合物的结构是用核磁共振结合其他波谱技术鉴 定确认的，具体为： 黄色胶状物，化合物米曲霉素A的紫外光谱(溶剂为甲醇）为im。、（loge):210(3.85)，268 (3. 52)，290 (3. 37)，328 (3.42)nm。红外光谱（漠化钟压片）为Kmax 3435，3076，2942，2854，1728，1660，1618，1573，1462，1357，1149，1056cm1。 HRESIMS显示本发明化合物准分子离子峰曲/么299. 0890[Μ+化]+(calcd299. 0895for CisHiA化)。结合"C和iHNMR谱（图1和图2,碳谱氨谱数据归属见表1)，推出分子式为 CisHiA，不饱和度为8。iHNMR谱（图2)中显示了 1个径基，1个1，2,3,5-四取代苯环信号， 1个Ξ取代締氨信号，4个亚甲基信号和1个甲基信号。在碳谱和DEPT(图1)中观测到了 15个碳原子信号，其中1个甲基，4个亚甲基，3个芳香次甲基和7个季碳信号(包括了2个 幾基和2个含氧季碳信号)。其中，2个幾基和4对双键碳占用了6个不饱和度，提示该分子 是一个二环类化合物。通过一维数据的仔细比对和分析，初步推测该化合物是一个含有一 个径基、一个2-幾基-丙基和一个3-径基-丙基片段的异香豆素类化合物。运些推测通 过二维核磁共振图谱得到确定（图3)。首先，通过H-4与C-1，C-3,C-4a，C-5和C-8a的相 关、H-6与C-4a，C-5,C-7和C-8的相关、W及H-8与C-4a，C-6,C-7和C-8a的相关确定了 化合物的基本骨架为异香豆素。其次，两个特殊的取代基(一个2-幾基-丙基和一个3-径 基-丙基）分别通过&-11与C-9和C-10相关W及&-3'与C-1相关而确定。最后，通过 &-9 与C-1，C-3 和C-4 相关、&-1' 与C-4a和C-6相关W及Ar-OH与C-6,C-7 和C-8相关， 确定了Ξ个取代基(一个径基、一个2-幾基-丙基和一个3-径基-丙基）的连接位置分别 为C-3，C-5和C-7。因此，该异香豆素类化合物结构得W确定，系统名为7-径基-3-(2-幾 基丙基）-5-(3-?基丙基）香豆素，并命名为米曲霉素A。其结构式为：
[0009]表1化合物米曲霉素A的电和"CNMR数据(溶剂为CDCI3)
本发明的第Ξ目的是运样实现的，所述的异香豆素类化合物在制备抗癌和抗病毒药物 中的应用。
[0010] 本发明所述的米曲霉o/y^ae)YNCA1292,已在中国微生物菌种保藏 管理委员会普通微生物中屯、保藏，保藏编号为CGMCCNo. 9716。（中国微生物菌种保藏管理 委员会普通微生物中屯、地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究 所，邮政编码：100101。）
[0011] 本发明化合物是首次被分离出来的，通过上述核磁共振和质谱测定方法确定了为 苯丙素类化合物，并表征了其具体结构。经实验，W米曲霉素A为原料，对NB4、A549、SHSY5Y和MC巧细胞株具有较好的细胞毒活性，IC5。值分别达4. 2、6. 5、7.6和8. 2 经对抗烟 草花叶病毒的实验，其相对抑制率在20 下达到28. 4%，略低于阳性对照品南宁霉素的 相对抑制率（33.8%)，说明化合物具有很好的抗烟草花叶病毒活性。本发明化合物结构新颖 且活性显著，可作为抗癌或抗病毒药物的先导性化合物，具有一定的应用价值。
【附图说明】
[0012] 图1为本发明化合物米曲霉素A的核磁共振碳谱（"CNMR); 图2为本发明化合物米曲霉素A的核磁共振氨谱（iHNMR); 图3为本发明化合物米曲霉素A的关键HMBC相关； 图4为曲霉属真菌米曲霉曲霉属真菌米曲霉示意图。
【具体实施方式】