一种猪流行性乙型脑炎病毒逆转录环介导等温扩增试剂盒及其应用
【专利说明】-种猪流行性乙型脑炎病毒逆转录环介导等温扩增试剂盒 及其应用
[0001]
技术领域
[0002] 本发明设及微生物检测技术领域，具体说是设及一种快速、可视化并且可实时定 量检测猪流行性乙型脑炎病毒的环介导等溫扩增试剂盒及其应用。
【背景技术】
[0003] 流行性乙型脑炎（/SjOanese 屈）是一种由流行性乙型脑炎病毒 CJEV)引起的W中枢神经系统损害为主的虫媒性人兽共患的自然疫源性传染病。巧V在溫 带热带地区主要W蚊子-水鸟或猪-水鸟的途径终年传播。目前，全球有30亿人口生活 在乙脑流行区，其主要流行于远东及东南亚国家和地区主要亚洲，W中国、印度和东南亚地 区流行较为严重。20世纪30年代，日本首个报道了巧的流行。1924年夏，日本和朝鲜爆 发大规模的乙型脑炎，6000多人感染，病死率达80%左右，在1958年，越南乙型脑炎流行 中，有6000多人感染。中国是乙型脑炎的流行区，近年全球报道的乙型脑炎近80%发生在 我国，每年报道有2万多例，病死率10%W上，且幸存者中约有15. 3%留有不同程度的后遗 症。
[0004] 猪是流行性乙型脑炎病毒的越冬宿主和主要扩增动物，携带病毒的猪是人乙型脑 炎的最主要传染源，呈猪-蚊-人链锁传播，人类的每一次乙型脑炎大流行均与猪群中的乙 型脑炎流行情况息息相关，因此乙型脑炎是亚洲公共卫生的重要问题之一，世界卫生组织 (01巧将其列为B类传染病，我国农业部将其归于二类动物疾病。因此，对猪源流行性乙型 脑炎诊断方法的研究十分必要。
[0005] 对乙型脑炎病毒的快速准确诊断是临床上防治猪流行性乙型脑炎病毒的关键。目 前实验室诊断巧V的方法大致可分为2类：①血清学方法，如化ISA方法、补体结合试验 (CT)、血凝抑制试验（HI)和中和试验（NT)、免疫细胞化学法等；②分子生物学方法。血清学 方法存在需要对急性期和恢复期的血清都进行检测，比较费时费力，且特异性和敏感性不 高等缺点，不利于对巧V的早期感染做出快速准确诊断。分子生物学方法包括PCR-ELISA 微板杂交法、RT-PCR、实时巧光定量PCR、基因忍片等，虽然此类方法较病毒分离鉴定方法快 速准确，但需要昂贵的仪器设备，成本较高，在结果判定上需要进行琼脂糖凝胶电泳，容易 造成实验室污染导致出现假阳性结果，也不适合基层和现场检测。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是为了解决基层检测猪流行性乙型脑炎病毒困难、耗时长和仪器昂 贵等问题，提供一种为基层简便、快捷准确地检测猪流行性乙型脑炎病毒的试剂盒，为实现 本发明目的所使用的技术方案为：一种猪流行性乙型脑炎病毒逆转录环介导等溫扩增试剂 盒，该试剂盒包括RT-LAMP引物、2X反应缓冲液、EM、巧光目视检测试剂、超纯水和猪流行 性乙型脑炎病毒RNA模板；所述的RT-LAMP引物包括外引物F3(沈QIDN0:1)与B3(沈Q10側：2)、内引物尸1?(沈9 10側：3)与81?(沈9 10側：4)和环引物1尸（569 10側：5) 与LB(沈QIDNO:6): 其中引物序列为： F3TGGGTGGACTTGGTGCTA B3TGGGCTTCTCCAGTCGTG FIPTCGATGTTGATCATGCGGACGTAGACAGCTGCTTGACAATCA BIPAGCTAGCCAACTTGCTGAGGTCAGCCACCGTCGAGATGTC LFTGTTGGTTTGTCGTTTGCCA LBGTTACTGCTATCATGCTTCAGTCA； 所述的 2X反应缓冲液是Tris-肥L、K化、Μ拆〇4、（NH4)2S〇4、Tween20、Betaine和dNTPs。
[0007]W上所述的猪流行性乙型脑炎病毒RNA模板是使用病毒基因组DNA/RNA提取试剂 盒提取的猪流行性乙型脑炎病毒的RNA。自猪流行性乙型脑炎病变组织样品或带毒蚊子中 提取的猪流行性乙型脑炎病毒的RNA。
[0008]W上所述的巧光目视检测试剂采用巧黄绿素巧光试剂，巧光试剂在反应前加入。
[0009]W上所述的2X反应缓冲液包括Tris-肥L35-55mM、K化15-35mM、Μ拆〇4 15-20mM、（畑4)25〇4 15-25mM、Tween20 0. 4-0. 8%、Betaine1.5-3. 0Μ和dNTPs2. 5-4mM， 其配制方法在抑为8.6条件下，将上述溶剂混合均匀获得。
[0010] 一种猪流行性乙型脑炎病毒逆转录环介导等溫扩增试剂盒的应用，用于兽医临床 上检测疑似猪流行性乙型脑炎病变组织或蚊子中是否含有猪流行性乙型脑炎病毒，具体检 测步骤包括： (1) RT-LAMP引物的设计与合成 (2) 猪流行性乙型脑炎病毒RNA模板的提取 (3) RT-LAMP反应体系的建立 (4) RT-LAMP检测方法。
[0011] W上所述的RT-LAMP反应体系建立W25μ1计， 2X反应缓冲液 12. 5μL EM 1 μL FIP 40 pmol BIP 40 pmol BIP 20 pmol LB 20 pmol F3 5 pmol B3 5 pmol 猪流行性乙型脑炎病毒RNA 5 μL 超纯水 补足25μL。
[0012]W上所述的RT-LAMP检测方法是采用特异性检测、敏感性检测和巧光可视化检测 的方法。
[0013]W上所述的RT-LAMP检测方法采用实时浊度仪进行密闭全程监控。
[0014] W上所述的RT-LAMP检测方法采用LoopampLA-320C实时浊度仪进行密闭全程监 控，反应溫度为63°C、反应在10-35分钟间出现扩增。
[0015] 本发明的实质性特点和进步是： 1)特异性强 本发明的RT-LAMP检测试剂盒特异性检测的阴性对照病毒和水对照均无阳性结果出 来，与PCR检测结果一致。且操作简便、快速获得检测结果、无需昂贵复杂的仪器。
[0016] 2)灵敏度高 普通PCR检测方法的灵敏度为1. 274X10 3ng/μレ而使用本发明的RT-LAMP检测方 法，检测限约为1.274X10 5ng/μL是普通PCR的100倍。 3)迅速获得结果 普通的RT-PCR整个过程在24小时左右才能得出结果，目前多数建立的RT-LAMP反应 方法在反应结束后，须采用琼脂糖凝胶电泳紫外线分析显像来判定结果，从病毒基因组RNA 提取到获取试验结果，需要4-5小时左右。本发明提供的RT-LAMP检测方法反应在11分钟 左右出现扩增，60分钟内即可完成扩增，且结果判读方式简便，在可见光下将阳、阴性管进 行比较，通过肉眼可明显看到阳性反应呈明显浑浊，阴性反应管透明；短暂离屯、后，阳性反 应管底部有明显的白色焦憐酸儀沉淀物，而阴性反应管底部无沉淀物；或加入巧光染料，阳 性反应管在紫外光下呈绿色，用肉眼便可观察实验结果。不需要再进行琼脂糖凝胶电泳紫 外线分析显像来判定结果，从基因组RNA提取到获得最终结果可在2-3小时内完成。
[0017] 4)不造成污染 目前RT-LAMP方法用于直接观察的巧光染料为反应后加入，而本发明的巧光染料是在 反应前加入的巧黄绿素商用染料(非syber-green)，检测过程不需要开盖。此外，本发明的 RT-LAMP检测方法在结果判定上，直接通过浊度仪检测反应管的浊度值来判定结果，可不进 行巧光染料法检测结果或者进行琼脂糖凝胶电泳检测结果，不需要开盖，能有效避免污染。
[0018] 5)可实时定量 本发明利用T'ubidimeterrea；L-timeLA-320浊度仪来实时分析RT-LAMP反应的结果， 不同的标准样品的浓度对应的浊度值的时间绘制成的标准曲线，代入标准曲线方程，即可 求出各时间的猪流行性乙型脑炎病毒拷贝数，达到定量检测产物的目的。
【附图说明】
[0019] 图1是本发明的RT-LAMP方法特异性检测结果，其中1 :猪流行性乙型脑炎病毒； 2:猪繁殖障碍与呼吸综合征病毒；3 : 口蹄疫病毒；4 :猪攝病毒；5 :猪圆环病毒2型；6:猪 细小病毒；7 :猪伪狂犬病毒；8:猪传染性胃肠炎病毒；9 :空白对照（水)。结果显示猪流行 性乙型脑炎病毒反应管出现浊度的上升曲线，7株对照病毒反应管和水对照反应管均无扩 增。
[0020] 图2和图3是分别使用本发明RT-LAMP方法和普通RT-PCR方法进行的猪流行 性乙型脑炎病毒敏感性检测的结果。其中1:1.27X102ng/yL;2:1.27Xl〇ing/yL;3: 1. 27X10°ng/yL;4 :1. 27X10ing/yL; 5 ：1. 27X10 ^g/μL；6：1. 27X10 ^g/μL；7 ： 1. 27X104ng/yL;8:1. 27X105ng/yL;9 :水（空白对照)。猪流行性乙型脑炎病毒基因组 RNA的起始浓度为1. 27X102ng/μL，经10倍倍比连续稀释后，进行RT-LAMP和PCR扩增， 结果显示本发明的RT-LAMP法检测限约为1. 27X10 5ng/μL而普通PCR方法检测限约为 1. 27X10 "ng/yLo
[0021] 图4是加入巧光染料后肉眼观察结果：左管为W猪流行性乙型脑炎病毒基因组 RNA为模板的反应情况，为阳性结果，右管为阴性对照的反应情况，为阴性结果。
[0022] 图5是本发明猪流行性乙型脑炎病毒定量标准曲线：利用不同的标准样品的浓度 对应的浊度值对时间绘制成的标准曲线，代入标准曲线方程，即可求出各时间的猪流行性 乙型脑炎病毒拷贝数。
【具体实施方式】
[002引 1、材料的准备 猪流行性乙型脑炎病毒、猪繁殖障碍与呼吸综合征病毒、口蹄疫病毒、猪攝病毒、猪圆 环病毒2型、猪细小病毒、猪伪狂犬病毒和猪传染性胃肠炎病毒，均为市售疫苗。RT-LAMP RNA扩增试剂盒购自北京蓝谱生物科技有限公司，货号LMP204 ;病毒基因组DNA/RNA提取试 剂盒，购自康为世纪生物科技有限公司，货号CW0548。
[0024] 2、RT-LAMP引物的设计与合成 根据GenBank中的乙型脑炎病毒E基因序列，利用RT-LAMP法引物辅助设计软件Prime巧xplorerV4软件设计一套RT-LAMP引物，其中F3、B3为外引物，FIP、BIP为内引 物，LF和LB为环引物， F3 TGGGTGGACTTGGTGCTA B3 TGGGCTTCTCCAGTCGTG FIPTCGATGTTGATCATGCGGACGTAGA