hirsutumL.Theor.Appl.Gene. 2003, 106:461-469.所述CTAB法并加W改进。在西瓜两 叶一屯、时取幼嫩叶片约2g，经液氮研磨，用CTAB裂解液（2%CTAB，2M化Cl，20mM邸ΤΑ， lOOmMTris-肥1(ρΗ=8. 0)与0. 2%的β-琉基乙醇）转入1.5ml离屯、管中，65°C水浴 0.化~比后取出冷却，加入等体积氯仿：异戊醇（24:1)混合物后轻轻摇晃0.化，将乳状 物W120(K)r/min转速离屯、8min~lOmin，取上清液用氯仿：异戊醇（24:1)抽提1次~2 次，加入10%醋酸钢和预冷的异丙醇，4°C冰箱静置化w上，收集絮状DM用70%乙醇洗涂 后干燥溶于TE中，4°C待充分溶解后备用。利用紫外/可见光光度计进行DNA纯度分析和 定量检测。
[0026] 2、西瓜InDel标记引物的设计
[0027] 开发引物所用的参考西瓜基因组序列来自葫芦科数据库化ttp://www. icugi. org/cgi-bin/lcugiVindex. cgi)。首先，利用InDel标记组装模块进行de nove组装，利用 S0APdenovo2(Illumina Plat化rm)组装产生重叠群；其次，通过同源比对，确定InDel候选 位点；再次针对InDel差异大的位点，利用R语言结合Primer 3. 0软件设计，大规模设计 InDel引物；最后，引物设计完成W后，由北京六合华大基因科技有限公司合成，共合成69 对InDel引物。
[0028] 3、PCR扩增
[0029] PCR扩增反应体系为20ul，其中含2μl基因组DNA(200ng/μl)，2μll0XPCR buffer(2.OmMMgCl2)，2. 0μ1dNTPs(2. 5πιΜ)，1.0μ1 正向引物（1〇μΜ)，1.0μ1 反向引物 (10μΜ)，0. 5μ1 2.SUnits/μ1TaqDM聚合酶灯AKARA)，11. 5μ1d地2〇。PCR扩增程序 为 94°C5min;94°C40S，55°C30S，72°C45S，36 个循环；72°ClOmin延伸，后于 4°C保存。在 VeritiTM96-well热循环仪（ABI，USA)上进行PCR扩增。
[0030] 4、凝胶电泳实验 阳03U 琼脂糖凝胶电泳。50XTAE电泳缓冲液：12. 2g Tris，2. 85血冰醋酸，10血 0. 25mol/L邸TA(PH 8.0)，加水至50血。凝胶制备：W电泳缓冲液为溶剂，称取Ig琼脂糖， 加50 XTAE电泳缓冲液2血和98血蒸馈水，溶解配成1. 2%的琼脂糖凝胶100血。稍冷 后，加入O.SygAiL邸混匀；安装好电泳槽和样品梳，灌胶，待胶冷却后，在电泳槽内倒入 1 X TAE电泳缓冲液。扩增后的DNA样品加入4μ L 6 X加样缓冲液（含有0. 25 %二甲苯菁 FF、0. 25%漠酪蓝、30%薦糖）稀释，混匀后用移液器加样。电泳时连接电极，在120V恒压 条件进行电泳，电泳时间为0.化~比，W扩增的DNA条带充分展开为止。 阳03引非变性聚丙締酷胺凝胶电泳。胶的配置（25血）：A;rc:Bis6. 65血；5XTBE5血；H2013血；TEMED20μL;10%AP0.3血。PCR产物在6%的聚丙締酷胺凝胶上分离。预电 泳50V~60V30min;120V电泳化~2.化。银染检测：凝胶采用0. 5%冰醋酸，10%的乙 醇固定12min~20min;0. 2%AgN〇3溶液染色lOmin~20min;蒸馈水洗涂两次后于显影液 (1.5%化地，0.4%甲醒，1%胞252〇3)显影；最后放于〇.75%胞2〇)3保存。
[0033] 对69个Indel引物扩增产物先进行琼脂糖凝胶电泳检测，对差异不明显的引物再 进行非变性聚丙締酷胺凝胶电泳检测，检测结果最终确定54个引物在抗病父本JRwOS-3和 感病母本JSwOl-1中产生了多态性Indel标记，运些Indel标记可应用于西瓜遗传图谱构 建、QTL定位、分子辅助育种及遗传多样性分析等研究。
[0034] 本发明所述的西瓜InDel分子标记的开发方法可应用于包括黄瓜、冬瓜、南瓜、丝 瓜在内的所有葫芦科作物InDel分子标记的开发。
[0035] 本发明可用其他的不违背本发明的精神或主要特征的具体形式来概述。凡是依据 本发明的实质技术对W上实施例所作的任何细微修改、等同变化与修饰，均属于本发明技 术方案的范围内。
【主权项】
1. 一组西瓜InDel分子标记，其特征在于：所述InDel分子标记包括有如下54个位点 所对应的正向和反向引物：2. 根据权利要求1所述的西瓜InDel分子标记的开发方法，其特征在于：该方法包括 以下步骤： 1) 对西瓜抗病自交系JRw08-3的基因组DNA进行提取； 2) 构建DNA文库，利用Illumina Hiseq2500平台进行PE150模式重测序；利用生物信 息学软件对序列进行清理、组装成Contigs ;通过大规模同源比对进行InDel位点的筛选； 利用R语言结合Primer3. 0引物设计软件，大规模设计InDel标记引物； 3) 利用InDel引物对西瓜基因组DNA进行PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳及非变性聚丙烯 酰胺凝胶检测。3. 根据权利要求2所述方法，其特征在于：在所述步骤3)中PCR扩增反应体系为 20ul，其中含 2 μ 1 基因组 DNA (200ng/ μ 1)，2 μ 1 10 X PCR buffer (2. OmM MgCl2)，2. 0 μ 1 dNTPs (2. 5mM)，1. 0 μ 1 正向引物（10 μ Μ)，1. 0 μ 1 反向引物（10 μ M)，0· 5 μ 1 2. 5Units/ μ 1 Taq DNA 聚合酶，11. 5 μ 1 ddH20。4. 根据权利要求2所述方法，其特征在于：所述步骤3)中PCR扩增程序为94°C 5min ; 94°C 40S，55°C 30S，72°C 45S，36 个循环；72°C lOmin。5. 根据权利要求2所述方法，其特征在于：所述步骤3)中琼脂糖凝胶电泳电压条件为 120V恒压，电泳时间为0. 5h~lh ;非变性聚丙烯酰胺凝胶电压条件为预电泳50V~60V 30min，120V 电泳 2h ~2. 2h。6. 根据权利要求2所述方法，其特征在于：该方法可应用于包括西瓜、黄瓜、冬瓜、南 瓜、丝瓜在内的所有萌芦科作物InDel分子标记的开发。7. 权利要求1所述的西瓜InDel分子标记在西瓜遗传图谱构建、QTL定位、分子辅助育 种及遗传多样性分析中的应用。
【专利摘要】本发明公开了西瓜InDel分子标记及其开发方法与应用，该方法以西瓜抗病自交系JRw08-3的基因组DNA模板为研究对象，利用Illumina平台进行重测序，采用Primer3.0引物设计软件，设计InDel引物。经过PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳及非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，在抗病父本JRw08-3和感病母本JSw01-1中筛选到了54个多态性的InDel标记，可应用于西瓜的遗传图谱构建、QTL定位、分子辅助育种及遗传多样性分析等研究。
【IPC分类】C12N15/11, C12Q1/68
【公开号】CN105331717
【申请号】CN201510830201
【发明人】刘广, 羊杏平, 徐锦华, 张曼, 李苹芳, 姚协丰, 侯茜, 朱凌丽, 任润生
【申请人】江苏省农业科学院
【公开日】2016年2月17日
【申请日】2015年11月24日