一种鉴定或辅助鉴定猪100kg体重眼肌面积的方法及其专用试剂盒的利记博彩app
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程领域，具体设及一种鉴定或辅助鉴定猪100kg体重眼肌面积 的方法及其专用试剂盒。
【背景技术】
[0002] 猪为六畜之首，养猪业在世界尤其是中国国民经济中占有重要地位。猪肉在诸多 肉类产品中的比重一直保持在Ξ分之一左右，是人们比较喜爱的副食之一。人们的生活不 断改善，传统的养殖技术已经不能满足人们对猪肉的需求量。随着现代育种技术的发展，猪 的生产性能显著提高，猪的健康养殖和育肥就显得格外重要。
[0003] 猪背腰厚和眼肌面积与猪瘦肉率直接相关，是猪的遗传育种和性能鉴定上的重要 指标参数，猪的眼肌面积越大，瘦肉率越高。遗传力是数量性状的重要参数，根据遗传力的 大小，可W预测遗传进展，个体育种值。因此，如何增加眼肌面积和提高瘦肉率，并提前做出 判断，是每个猪场经营者及育种学家追求的目标。
[0004] 近十年来，分子生物技术的发展为猪的育种提供了一种基于DNA变异的新型遗传 标记。特别是分子标记辅助选择技术的出现，为显著改善猪的运些数量性状提供可能。
【发明内容】
阳0化]本发明的一个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定猪100kg体重眼肌面积和/或瘦肉 率的方法。
[0006] 本发明提供的鉴定或辅助鉴定猪100kg体重眼肌面积和/或瘦肉率的方法是检测 待测猪的H19基因的第16位脱氧核糖核巧酸是C还是T还是C和T，W确定待测猪的基因 型是TT基因型还是CC基因型还是TC基因型，根据所述猪的基因型确定所述猪100kg体重 眼肌面积和/或瘦肉率的大小：TT基因型的猪个体100kg体重眼肌面积和/或瘦肉率大于 CT基因型的猪个体，CT基因型的猪个体100kg体重眼肌面积和/或瘦肉率大于CC基因型 的猪个体；
[0007] 所述CC基因型为H19基因自5'末端第16位脱氧核糖核巧酸为C的纯合体；
[0008] 所述CT基因型为H19基因自5'末端第16位脱氧核糖核巧酸为C和T的杂合体；
[0009] 所述TT基因型为H19基因自5'末端第16位脱氧核糖核巧酸为T的纯合体；
[0010] 所述化9基因的核巧酸序列如序列表中序列1所示。
[0011] 上述方法中，所述检测待测猪的H19基因的第16位脱氧核糖核巧酸是T还是C还 是T和C的方法为如下A)或B): 阳〇1引A)直接测序；
[0013]B)用能够扩增含有猪H19基因的第16位脱氧核糖核巧酸的引物对扩增所述待测 猪的基因组DNA，得到PCR扩增产物，如果PCR扩增产物自5'末端起第16位的碱基均为C， 则所述猪的基因型为CC基因型，如果PCR扩增产物自5'末端起第16位的碱基为C和T，则 所述猪的基因型为CT基因型，如果PCR扩增产物自5'末端起第16位的碱基均为Τ，则所述 猪的基因型为ΤΤ基因型。
[0014] 上述方法中，所述Β)包括如下步骤：所述扩增所用的引物对满足如下条件：W所 述猪个体的基因组DNA为模板进行PCR扩增的产物含有Η19基因的第16位脱氧核糖核巧 酸；
[0015] 所述引物对为由序列表中序列2所示的单链DNA分子和序列表中序列3所示的单 链DNA分子组成的引物对。
[0016] 本发明的另一个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定猪100kg体重眼肌面积和/或瘦 肉率的试剂。
[0017] 本发明提供的鉴定或辅助鉴定猪100kg体重眼肌面积和/或瘦肉率的试剂是检测 待测猪的H19基因的第16位脱氧核糖核巧酸是T还是C还是T和C的物质；
[001引所述化9基因的核巧酸序列如序列表中序列1所示。
[0019] 上述试剂中，所述物质为由序列表中序列2所示的单链DNA分子和序列表中序列 3所示的单链DNA分子组成的引物对。
[0020] 本发明还有一个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定猪100kg体重眼肌面积和/或瘦 肉率的试剂盒。
[0021] 本发明提供的鉴定或辅助鉴定猪100kg体重眼肌面积和/或瘦肉率的试剂盒含有 上述试剂。
[0022] 上述试剂或上述试剂盒在鉴定或辅助鉴定猪100kg体重眼肌面积中的应用也属 于本发明的保护范围。
[0023] 上述试剂或上述试剂盒在制备鉴定或辅助鉴定猪100kg体重眼肌面积的产品中 的应用也属于本发明的保护范围。
[0024] 上述试剂或上述试剂盒在鉴定或辅助鉴定猪瘦肉率中的应用也属于本发明的保 护范围。
[00巧]上述试剂或上述试剂盒在制备鉴定或辅助鉴定猪瘦肉率的产品中的应用也属于 本发明的保护范围。
[00%] 上述方法或上述试剂或上述试剂盒在猪育种中的应用也属于本发明的保护范围。
[0027] 上述方法或上述试剂或上述试剂盒在选育瘦肉率高和/或100kg体重眼肌面积大 的种猪中的应用也属于本发明的保护范围。
[0028] 本发明的最后一个目的是提供一种选育瘦肉率高和/或100kg体重眼肌面积大的 种猪的方法。
[0029] 本发明提供的选育瘦肉率高和/或100kg体重眼肌面积大的种猪的方法包括选择 TT基因型的猪进行育种；
[0030] 所述TT基因型为H19基因的第16位脱氧核糖核巧酸为T的纯合体；
[0031] 所述化9基因的核巧酸序列如序列表中序列1所示。
[0032] 本发明发现了猪H19基因的第四内含子的C16T位点对猪100kg体重眼肌面积有 显著影响，并基于该SNP位点提供了一种鉴定或辅助鉴定猪100kg体重眼肌面积的方法：ΤΤ 基因型的猪个体100kg体重眼肌面积高于CT基因型的猪个体，CT基因型的猪个体100kg体 重眼肌面积高于CC基因型的猪个体。通过试验证明：本发明的方法可W准确并快速的鉴定 猪100kg体重眼肌面积，对猪的遗传育种和性能鉴定具有重要的参考意义。
【具体实施方式】
[0033] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0034] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0035] 下述实施例中的猪100kg体重眼肌面积为猪体重达到100kg时的活体眼肌面积。
[0036] 实施例1、一种鉴定或辅助鉴定猪100kg体重眼肌面积的方法
[0037] 一、猪H19基因的SNP位点的筛选
[0038]1、猪耳组织样品DNA的提取
[0039] 分别采集来自河北猪场的32头长白猪的血液样品，样品采集后，保存于75%酒精 中，并于-20°C保存。采用苯酪-氯仿抽提法提取血液样品的基因组DNA，得到猪耳组织的 基因组DNA。具体步骤如下：
[0040] (1)耳组织样的准备：剪取大小适中的耳组织样，用生理盐水冲洗掉表面的杂质 和血污，放于1. 5ml离屯、管中，用眼科剪剪碎，并向其中加入500UL的组织裂解液（北京百 泰科生物技术有限公司；产品编号：AU19011);
[OOW似根据所剪取的耳组织样的大小，向离屯、管中加入25uL的蛋白酶K(SIGMA-ALDRICH;产品编号：SRE0005);
[0042] (3)放于水浴摇床上，55°C消化过夜，确保耳组织样消化完全，得到消化彻底的耳 组织；
[0043] (4)将上述消化彻底的耳组织样于室溫放置，加入等体积的Tris-饱和酪（江苏宝 莱生物科技有限公司），翻覆颠倒混匀5min;
[0044] 巧）14000巧m/min离屯、lOmin，离屯、管中会出现分层现象，上层为含有核酸的水 相，下层为含有其他杂质的有机相；
[0045] (6)利用微量移液器小屯、吸取上层含核酸的水相，放置于一个新的1. 5ml离屯、管 中（为了避免吸起下层的有机相，最好用去除尖头的蓝枪头），弃下层有机相；
[0046] (7)重复步骤（4)~化）；
[0047] (8)向含有水相的离屯、管中加入等体积的饱和酪：氯仿=1 :1，反复颠倒混匀 5min，14000巧m/min离屯、lOmin，然后吸取上层液体，放于一个新的1. 5血离屯、管中； W48] (9)重复步骤做；
[0049] (10)向其中加入饱和酪、氯仿和异戊醇，饱和酪：氯仿：异戊醇的体积比为25 :24: 1，翻覆颠倒混匀，14000;rpm/min离屯、lOmin;
[0050] (11)吸除上层液体，加入2倍体积的无水乙醇（事先放于-20°C冰箱内预冷）沉 淀DNA，此时会在离屯、管内出现丝状或絮状DNA沉淀；
[(X)川用黄色枪头小屯、的挑出丝状或絮状DNA沉淀，放于一个新的1. 5血的EP管， 向其中加入70%乙醇（-20°C预冷）500祉，洗涂DNA沉淀，溫和颠倒30s，弃70%乙醇；
[0052] (13)重复步骤（12);
[0053] (14)将含有DNA沉淀的离屯、管放于室溫环境中，干燥20~30min;
[0054](15)加入60~80uL的TE缓冲液或双蒸水溶解DM沉淀（勿剧烈振荡或离屯、）， 将其保存于-20°C冰箱内。
[0055] 2、目的片段的扩增及测序
[0056] (l)PCR扩增
[0057] W步骤1获得的基因组DNA为模板，采用上游引物：TGCCCAACCTGAGCCCTGAC(序列 2)和下游引物：TCCCACCAGACTCGCTTGA(序列3)进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
[0058]PCR扩增体系：10XLAPCRBuffer化l，10mMdNTPMix1.6ul，上下游引物 (lOpmol/L)各lul，LATaqDM聚合酶巧U/ul)，基因组DMlul，d地20 13. 2ul。
[0059]PCR反应程序：94°C预变性，5min;94°C变性，30s，58°C退火，30s，72°C延伸，30s， 72°C延伸，lOmin。
[0060] (2)PCR产物的回收纯化
[0061] 利用琼脂糖凝胶纯化回收试剂盒（北京百泰克生物技术