一种食品中副溶血弧菌的检测试剂盒及检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于食品检测领域，具体涉及一种食品中副溶血弧菌的检测试剂盒及检测 方法。
【背景技术】
[0002] 副溶血弧菌是一种革兰阴性多形态杆菌，在自然界中分布广泛，海产品如海哲、黄 泥螺及蟹类等其携带率最高，此外蛋类、新鲜蔬果及肉制品中也较常见。当人们直接或间接 食用含有该菌的食物后，可引起肠道疾病，如腹泻、胃肠炎，此外，还可引起其他系统疾病， 如关节炎及必脏疾病。副溶血弧菌是目前细菌性食物中毒中最主要的病原菌，给人类健康 造成极大的危胁，对水产养殖业造成了巨大的经济损伤。
[0003] 副溶血弧菌传统的鉴定与检测方法包括镜检、生化鉴定、嗜盐性试验、免疫色谱法 及DNA杂交法等，但均存在各自不足之处，如镜检、生化鉴定、嗜盐性试验操作复杂、检测时 间长，且灵敏度低，而免疫色谱法及DNA杂交法对设备要求高，而检测过程易受污染物影 响。本发明提供一种英光定量PCR检测方法，对食品中副溶血弧菌进行检测时，特异性强、 敏感性高，操作简便，检测迅速，可避免常规PCR检测方法产生的一系列问题，
【发明内容】
[0004] 本发明针对上述现在技术的缺陷，提供一种操作简便、准确率高、检测成本低、无 污染、假阳性率低的检测试剂盒及检测方法。
[0005] -种食品中副溶血弧菌英光定量PCR检测试剂盒，所述检测试剂盒包括培养基及 检测液，所述的培养基为含有2%氯化钢结晶紫增菌液的嗜盐菌选择性琼脂培养基，所述的 检测液由W下含量的组分制成：
[0006] 表爾活性荆 5-! 0ml 碱溶液 2-5ml
[0007] 酸溶液 2-5ml 傑护液 5-8ml DNA提取液 20-50uJ !〇X段旌缓冲液 ！-5讯} 叠鑛漠化之锭 BsiDNA聚合酶 5-lOul PC民引物 5-iOul
[000引优选的，所述的表面活性剂选自吐温20、吐温40、甜菜碱中的一种或多种，所述的 表面活性剂浓度为5-lOmg/ml。
[0009] 优选的，所述的碱溶液选自化OH、K0H中的一种或多种，浓度为1-1.8mg/ml，优选 的，所述的化0H、K0H体积比为（2-6) : (3-5)，；所述的酸溶液选自肥L、肥S04中的一种或 多种，所述的肥U肥S04的体积比为（2-5) : (1-8)，浓度为2-3mg/ml。
[0010] 优选的，所述的DM提取液为0. 5-0.8mmol/L的Tris-HCl。
[0011] 优选的，所述的BstDM聚合酶浓度为0. 35-0. 4U/
[0012] 所述的 10X反应缓冲液为 20-50mlTris-肥 1、6-I0ml0. 2-0. 5mg/mlKC1、 6-10mll.8-3. 5mg/mlNH4S04、10-15ml2. 8-5. 5mg/mlΜ拆04 的混合液。
[001引所述的PCR引物由FAM标记5'，TRAMA标记3'，上游： 5-CGGTAGTAAACACACT-GTCAG-3 ;下游；5-GTTTCAGGCTCACCATGACG-3 ;
[0014] 一种采用如上所述的检测试剂盒对食品中副溶血弧菌进行检测的方法，包括W下 步骤：
[0015] (1)细菌培养：在培养基中加入增菌液5-lOml，氯化钢0. 5-2g，蛋白腺3-6g，固体 样品取样10-20mg，用均质器打碎，液体样品取样3-8ml，充分摇匀，对样品进行预处理后， 置培养基中培养，培养温度为35-371：，培养时间为6-12h;并设已知无副溶血菌感染的食 品样品为空白对照组；
[0016] (2)将步骤（1)中培养后的可疑菌落取出，加入无菌生理盐水，并加入无菌酸试剂 或碱试剂，制成PH=8. 4-8.8的菌悬液；
[0017] (3)将步骤（2)中制得的菌悬液离必5-8min，弃上清，加入DNA提取液80-100ml， 加入叠氮漠化己锭10-20ml，混匀加热，加热温度为90-95°C，加热时间为5-lOmin，离必，弃 上清，得样品待测液；
[001引 （4)将步骤（4)中制得的样品待测液加入5-10至PCR管中，于63°C恒温水浴箱内 进行恒温扩增反应，反应时间为60-90min;
[0019] (5)在步骤（4)中的反应产物中加入SYBRGreenI英光染料，观察颜色，阳性： 绿色，阴性：澄红色；对阳性者进行英光定量PCR检测，具体方法为；93°C预变性3min，55°C 变性30s，40个循环，Imin退火及延伸，读英光值，英光激发波长为485-500nm，检测波长为 525nm。
[0020] 本发明与现有技术相比，具有W下优点：
[0021] 1.本发明整个操作过程均在密封单管内完成，避免了常规PCR检测时扩增产物污 染，同时本发明还设立了空白对照组，使检测结果更易判断，提高了检测结果的准确性。
[0022] 2.本发明所需仪器简单，操作简便，经常规PCR仪进行循环，经国产微量英光检测 仪测英光值，经简单计算即可得出检测结果，在我国基层医院及偏远地区均可推广使用，且 其特异性比传统方法及常规PCR法明显升高。
[0023] 3.本发明检测前先将待测样品置于特定培养基类进行细菌培养，可增加目的细 菌，减少PCR干扰物，明显提高定性检测低限，可达2c化/g，即明显降低了假阳性与假阴性 率，同时，也明显缩短培养时间，缩短检测时间，在细菌培养后，加入酸或碱试剂调节PH，更 利于后续的DNA提取。
【具体实施方式】
[0024] 实施例1
[0025] -种食品中副溶血弧菌英光定量PCR检测试剂盒，所述检测试剂盒包括培养基及 检测液，所述的培养基为含有2%氯化钢结晶紫增菌液的嗜盐菌选择性琼脂培养基，所述的 检测液由W下含量的组分制成：
[0026] 表爾活性菊 纖磯鐵這ml酸溶液 細重1 麵妒觀 縱? DNA提取液 20ul iOX反腐鑛冲液 1ml *鐵澳化己锭 校st：DNA聚合酶 5d PC民弓[物 茹1
[0027] 所述的表面活性剂为吐温20,浓度为5mg/ml。
[0028] 所述的碱溶液为化0H，浓度为Img/ml ;所述的酸溶液为肥L浓度为2mg/ml。
[0029]所述的DNA提取液为 0. 5mmol/L的Tris-HCl。
[0030] 所述的BstDNA聚合酶浓度为0.35U/U1
[0031]所述的 10X反应缓冲液为 20mlTris-肥l、6ml0. 2mg/mlKCl、6mll.8mg/ml NH4S04、10ml2.8mg/mlM拆04 的混合液。
[003引所述的PCR引物由FAM标记5'，TRAMA标记3'，上游： 5-CGGTAGTAAACACACT-GTCAG-3;下游；5-GTTTCAGGCTCACCATGACG-3;
[0033] 一种采用如上所述的检测试剂盒对食品中副溶血弧菌进行检测的方法，包括W下 步骤：
[0034] (1)细菌培养：在培养基中加入增菌液5ml，氯化钢0. 5g，蛋白腺3g，固体样品取样 lOmg，用均质器打碎，液体样品取样3ml，充分摇匀，对样品进行预处理后，置培养基中培养， 培养温度为35°C，培养时间为化；并设已知无副溶血菌感染的食品样品为空白对照组；
[0035] (2)将步骤（1)中培养后的可疑菌落取出，加入无菌生理盐水，并加入无菌酸试剂 或碱试剂，制成PH=8. 4的菌悬液；
[003引 做将步骤似中制得的菌悬液离必5-8min，弃上清，加入DNA提取液80ml，加入 叠氮漠化己锭10ml，混匀加热，加热温度为9(TC，加热时间为5min，离必，弃上清，得样品待 测液；
[0037] (4)将步骤（4)中制得的样品待测液加入5-10至PCR管中，于63°C恒温水浴箱内 进行恒温扩增反应，反应时间为60min;
[0038] (5)在步骤（4)中的反应产物中加入SYBRGreenI英光染料，观察颜色，阳性：绿 色，阴性：澄红色；对阳性者进行英光定量PCR检测，具体方法为；93°C预变性3min，55°C变 性30s，40个循环，Imin退火及延伸，读英光值，英光激发波长为485nm，检测波长为525nm。[00測 实施例2
[0040] 一种食品中副溶血弧菌英光定量PCR检测试剂盒，所述检测试剂盒包括培养基及 检测液，所述的培养基为含有2%氯化钢结晶紫增菌液的嗜盐菌选择性琼脂培养基，所述的 检测液由W下含量的组分制成：
[0041] 表兩活性趙 10ml 繼癖繼： 細1 酸溶液 如il 保护液 8ml DNA提取液 洗ul 10X反应緩冲液 如li #鐵澳化乙锭 6m! 悦tONA.潔命酶 10i.ii PCR.巧l·物 lOiil
[0042] 所述的表面活性剂为甜菜碱，浓度为lOmg/ml。
[0043] 所述的碱溶液为K0H，浓度为1.8mg/ml;所述的酸溶液为肥S04中的一种或多种， 浓度为3mg/ml。
[0044]所述的DM提取液为 0.8mmol/L的Tris-HCl。
[0045] 所述的BstDNA聚合酶浓度为0.4U/
[0046]所述的 10X反应缓冲液为 50mlTris-肥lUOmlO. 5mg/mlKCl、10ml3. 5mg/ml NH4S04、15ml5. 5mg/mlM拆04 的混合液。
[0047]所述的PCR引物由FAM标记5'，TRAMA标记3'，上游： 5-CGGTAGTAAACACACT-GTCAG-3 ;下游；5-