一种基于自然转化的副猪嗜血杆菌高效遗传重组方法及应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于细菌遗传改造技术领域，特别设及一种基于自然转化的副猪嗜血杆菌 高效遗传重组方法及应用。
【背景技术】
[0002] 同源重组技术常用于细菌基因功能研究或遗传改造，同源重组技术是利用已构建 好的带有目标基因敲除盒的外源质粒载体通过一定方式引入菌体细胞，带有同源序列的片 段会与目标基因进行同源配对，在多个重组相关蛋白的作用下实现DNA片段交换，从而实 现细菌目标基因改造的目的。要实现外源质粒载体的导入通常用到接合转移，电击转化或 自然转化等方法，其中自然转化是指菌体高效吸收和整合外源核酸DNA的能力，一般认为 自然转化能力的出现是细菌利用外源DNA作为营养物质或修复自身基因组损伤的一种机 审IJ。利用自然转化的特性，至今已证实有多种细菌能通过运种方式成功实现基因定向突变， 是实现细菌遗传研究的有效手段之一。
[0003] 目前，大部分关于副猪嗜血杆菌化.parasuis)突变体的构建主要是通过自然转 化的方法实现的，Bigas等首先发现H.parasuis存在环腺巧酸（cAMP)依赖的自然转化现 象，能获取含有吸收信号序列（uptakesignalsequence,US巧的外源核酸片段，利用此特 性，Bigas等首次在H.parasuis上构建出了胸巧酸合成酶（thyA)基因缺失突变株。
[0004] 随后有多项研究通过自然转化的方法构建多个H.parasuis突变体，包括外膜 蛋白ompP2和ompP5基因，脂寡糖合成相关基因opsX、计aF和waaQ，半乳糖代谢相关基 因gal肥W及细胞肿胀毒素基因C化ABC，此外还有多个致病相关基因，并证实运些基因与 比parasuis抗补体或粘附入侵相关，为H.parasuis致病机理的研究提供了可靠的遗传研 究方法。
[0005] 本技术在利用自然转化的基础上进一步优化重组方法，进一步提高副猪嗜血杆菌 遗传改造效率。
【发明内容】
[0006] 为克服上述现有技术中存在的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种基于 自然转化的副猪嗜血杆菌高效遗传重组方法。本发明的遗传重组方法无需构建载体，也不 需要电击，直接用PCR产物跟菌混合完成；克服了传统遗传重组方法中需要构建载体和点 击转化等繁琐步骤。
[0007] 本发明的另一目的在于提供上述的基于自然转化的副猪嗜血杆菌高效遗传重组 方法的应用。
[0008] 本发明的目的通过下述技术方案实现：一种基于自然转化的副猪嗜血杆菌高效遗 传重组方法，具体包括W下步骤：
[0009] 1) W副猪嗜血杆菌基因组为模板，设计重组目标基因的上臂扩增引物对和下臂扩 增引物对，分别扩增获得目标基因上臂片段和目标基因下臂片段，其中所述的上臂扩增引 物对的上游引物中包含USS序列（uptakespecificsequence);
[0010] 2)扩增获得抗性标记基因，所述的抗性标记基因的前端序列与目标基因上臂片段 后端序列存在部分重叠，所述的抗性标记基因的后端序列与目标基因下臂片段前端存在部 分重叠片段，W目标基因上臂片段的上游扩增引物和目标基因下臂片段的下游扩增引物进 行重叠PCR扩增，获得依次排列有USS序列、目标基因上臂片段、抗性标记基因和目标基因 下臂片段的重组片段PCR产物；
[0011] 3)将步骤2)获得重组片段与受体副猪嗜血杆菌进行自然转化，经过对抗性标记 基因的筛选，获得副猪嗜血杆菌的重组突变体。
[001引 步骤1)中所述的USS序列为ACCGCTTG。
[0013] 步骤1)中所述的目标基因优选为副猪嗜血杆菌的qseC、qseB、arcA、arcB、cpxR 和cpxA等基因。
[0014] 步骤2)中所述的抗性标记基因优选为GmR抗性标记基因或KanR抗性标记基因中 的一种。
[001引步骤如中所述的自然转化，具有步骤如下：将受体副猪嗜血杆菌接种于TSA平板， 含5%C02培养箱37°C培养2地，之后用TSB把菌体从平板中冲洗下来，用TSB培养基把菌 体浓度调整为109c化/ml;取20μL菌液置于TSA平板上，加入1μg步骤2)获得的重组片 段PCR产物，用接种环混合后置于培养箱中37°C培养化，之后用TSB再次把菌体洗下，离 屯、，去上清后加入100μLTSB培养基悬浮菌体，然后把菌液涂布在含有Gm的TSA平板上， 37°C培养2天，完成自然转化，同时用TEbuffer做阴对照。
[0016] 上述的基于自然转化的副猪嗜血杆菌高效遗传重组方法应用于构建副猪嗜血杆 菌化.parasuis)双组分系统突变体。
[0017] 作为优选的实施方式，W双组分系统qseC突变体的构建方法为例，具体步骤如 下：
[0018] 1)W副猪嗜血杆菌基因组为模板，设计重组qseC基因的上臂扩增引物对和下臂 扩增引物对，分别扩增获得qseC基因上臂片段和qseC基因下臂片段，其中所述的上臂扩增 引物对的上游引物中包含USS序列（uptakespecificsequence);所述的上臂扩增引物对 为：
[0019]P1 (qseC-up-F)：ACCGCTTGTAAATACCAGTTTGCGTTTTC；
[0020] P2(qseC-up-R)：ATGTCAATTCGGGATCCGCGCACACAATCAAGCCCAATAA；
[0021] 所述的下臂扩增引物对为：
[0022] P3 (qseC-down-F)：GATCGGCTTCGTCGACACGTAGGATGGAGATATAAGGCAC；
[0023]P4 (qseC-down-R)：TGCCAACAGCAATCACAGTA；
[0024]2)扩增获得GmR抗性标记基因，所述的GmR抗性标记基因的前端序列与qseC基因 上臂片段后端序列存在部分重叠，所述的GmR抗性标记基因的后端序列与qseC基因下臂片 段前端存在部分重叠片段，W qseC基因上臂片段的上游扩增引物P1 (qseC-up-巧和qseC 基因下臂片段的下游扩增引物P4(qseC-down-R)进行重叠PCR扩增，获得依次排列有USS 序列、目标基因上臂片段、抗性标记基因和目标基因下臂片段的重组片段PCR产物；
[00巧]3)将步骤2)获得重组片段与受体副猪嗜血杆菌进行自然转化，经过对抗性标记 基因的筛选，获得副猪嗜血杆菌的重组qseC突变体。
[0026] 步骤1)中所述的USS序列为ACCGCTTG。
[0027] 步骤3)中所述的自然转化，具有步骤如下：将受体副猪嗜血杆菌接种于TSA平板， 含5%C〇2培养箱37°C培养2地，之后用TSB把菌体从平板中冲洗下来，用TSB培养基把菌 体浓度调整为109c化/ml;取20μL菌液置于TSA平板上，加入1μg步骤2)获得的重组片 段PCR产物，用接种环混合后置于培养箱中37°C培养化，之后用TSB再次把菌体洗下，离 屯、，去上清后加入100μLTSB培养基悬浮菌体，然后把菌液涂布在含有Gm的TSA平板上， 37°C培养2天，完成自然转化，同时用TEbuffer做阴对照。
[0028] 上述重组方法中，所用的特异性引物是本发明人根据NCBI数据库上的测序菌株 S册165的序列进行设计所得。
[0029] 上述重组方法中，本发明人提取的H.parasuis基因组DNA作为模版，参照TaKaRa ExTaq聚合酶的使用说明进行PCR扩增，PCR产物或酶切产物按照GelExtraction Kit(OmegaInc)试剂盒说明进行回收得到重组基因。
[0030] 其余双组分系统突变株包括93日8、日1^4、日1^8、。9成和。9义4的构建用相同的方法， 不同的是用KanR抗性基因替代GmR，获得Km抗性的突变体。
[0031] 本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
[0032] 本发明中通过在上游引物中添加USS序列（ACCGCTTG)，使的PCR产物含有运个 USS序列，副猪嗜血杆菌会识别并带入菌体内部进行重组，无需构建突变常用的自杀质粒， 自杀质粒是指载体不能在菌体中复制，只有发生重组的菌才能获得抗性基因，才能生存，本 方法把抗性基因直接引入到PCR产物中，直接用PCR产物就能实现筛选，同时在引物中引入 USS，细菌就会直接吞隧运个重组模版用于同源重组。
[0033] 1.本发明的遗传重组方法无需构建任何载体，能快速高效实现副猪嗜血杆菌突变 体的构建；
[0034] 2.本发明的遗传重组方法实现更简便的转化，无需做感受态，无需电击，直接混 合，然后涂板，经抗性筛选即可获得副猪嗜血杆菌突变体；
[0035] 3.本发明成功构建了多个副猪嗜血杆菌双组分系统突变体，说明此方法可靠性 高，能有效实现目的基因的祀向突变。
[0036] 4.本发明多种抗性突变体的成功构建，说明此方法能灵活利用抗性标记基因，为 多基因敲除研究提供技术基础。
【附图说明】
[0037] 图1为qseC突变株PCR鉴定图；其中A为PCR鉴定的原理图；B为PCR鉴定产物 的电泳结果图；泳道1，qseC突变株Gm抗性基因扩增；泳道2,野生菌株SC096Gm抗性基因 扩增；泳道M，DNA分子量Marker;泳道3,用引物P1与P238从qseC突变株扩增突变株特 征片段；泳道4,用引物P1与P238从SC096扩增突变株特征片段。
[0038] 图2qseB突变株PCR鉴定；其中A为PCR鉴定的原理图；B为PCR鉴定产物的电 泳结果图；泳道1，用引物P21与P254从qseB突变株扩增突变株特征片段；泳道2,用引物 P21与P254从SC096扩增突变株特征片段；泳道M，DNA分子量Marker。
[0039] 图3cpxA或cpxR突变株PCR鉴定；其中A为PCR鉴定的原理图；B为PCR鉴定产 物的电泳结果图；泳道1，用引物P9与P254从cpxA突变株扩增突变株特征片段；泳道2,用 引物P9与P254从SC096扩增突变株特征片段；泳道3,用引物P5与P254从cpxA突变株 扩增突变株特征片段；泳道4,用引物P5与P254从SC096扩增cpxR突变株特征片段；泳道 M，DNA分子量Marker。
[0040] 图4arcA或arcB突变株PCR鉴定；其中A为PCR鉴定的原理图；B为PCR鉴定产 物的电泳结果图；泳道1，用引物P14与P254从arc