属于GH3家族的耐热性β-木糖苷酶的利记博彩app
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种耐热性β-木糖巧酶、编码上述耐热性β-木糖巧酶的多核巧酸、 用于表达上述耐热性β-木糖巧酶的表达载体、整合了上述表达载体的转化体、W及使用 上述耐热性β-木糖巧酶的木质纤维素分解产物的制造方法。
[0002] 本申请要求基于2014年8月4日在日本申请的特愿第2014-158650号的优先权， 并在本文中引用其内容。
【背景技术】
[0003] 除了对运输用能源供应的担忧之外，由于全球变暖和大气污染等环境上的问题， 近年来，石油替代能源的开发成为非常重要的课题。植物生物质是地球上最丰富的可再生 能源，作为石油替代资源而备受期待。作为植物生物质的主要成分的木质纤维素为纤维素、 半纤维素（包含木聚糖、阿拉伯聚糖和甘露聚糖）等多糖类，W及木质素。运些多糖类被各 种糖巧水解酶水解为葡萄糖或木糖等单糖后，用作生物燃料或化学品原料。
[0004] 具有复杂结构的木质纤维素是难分解性的，难W用单一的酶分解或糖化 (hy化olysis)。因此，对于多糖类中的纤维素的水解，通常需要糖巧水解酶中的内切葡聚糖 酶（内切-1，4-β-D-葡聚糖酶，EC3. 2. 1. 4)、外切型纤维二糖水解酶（1，4-β-纤维二糖 糖巧酶（cellobiosidase)或纤维二糖水解酶，EC3. 2. 1. 91、EC3. 2. 1. 176)、β-葡糖巧酶 巧C3. 2. 1. 21)运Ξ种酶。另一方面，半纤维素的构成因植物的种类而异，例如，在阔叶树和 草本植物中，木聚糖构成了主要成分。对于木聚糖的水解，需要木聚糖酶（内切-1，4-β-木 聚糖酶，EC3. 2. 1.8)、β-木糖巧酶巧C3. 2. 1. 37)。β-木糖巧酶对通过木聚糖酶水解半 纤维素生成的低聚糖进行水解，是设及单糖生成工艺的水解酶之一。 阳0化]在W往的W木质纤维素为资源的生物乙醇的制造中，W乙醇的高能效转化为目 的，尝试了基于高固液比（30~60%的固液比）的糖化处理（hy化olysisprocess)。运种 基于高固液比的木质纤维素的酶糖化，生物质糖化液的粘性高，难W进行木质纤维素的水 解反应。因此，通过使用耐热性酶在例如80°CW上的高溫下进行木质纤维素的酶解糖化处 理，除了加快水解反应速度之外，降低了生物质糖化液的粘性，从而有望实现缩短糖化反应 时间并降低酶量。因此，对于各种糖巧水解酶，期望开发耐热性更优异的酶。
[0006] 大多数耐热性糖巧水解酶可W通过如下方式获得：对生存于高溫环境下的嗜热性 微生物进行分离鉴定，从运些分离培养的微生物中克隆基因，确定DNA序列后，利用大肠杆 菌或丝状真菌等表达而获得。例如，专利文献1公开了来源于丝状真菌的β-木糖巧酶，专 利文献2公开了在30°C表现出酶活性的、来源于丝状真菌米曲霉（Aspergillus0巧zae)的 0-木糖巧酶。专利文献3中公开了在抑5.5W下、50°CW上表现出酶活性的、来源于酸热 脂环酸芽抱杆菌（Alixyclobacillusacidocaldarius)的β-木糖巧酶。专利文献4公开 了在45°C表现出酶活性的、来源于解纤维顶抱霉（Acremoniumcellulolyticus)的β-木 糖巧酶。另外，非专利文献1~6报道了最适溫度为6(TC左右的、分离自特定细菌或丝状真 菌的β-木糖巧酶。
[0007] 现有技术文献 阳00引专利文献
[0009] 专利文献1 :特表平第11-507837号公报
[0010] 专利文献2 :特开平第11-313683号公报
[0011] 专利文献3 :特表第2011-523346号公报
[0012] 专利文献4 :特开第2013-59272号公报
[0013] 非专利文献
[0014] 非专利文献 1 :Ko;rmelink等，《JournalofBiotechnology(生物技术杂志）》， 1993 年，第 27 卷，第 249-265 页。
[0015] 非专利文献 2iHerrmann等，《BiochemicalJournal(生化杂志）》，1997 年，第 321 卷，第375-381页。
[0016] 非专利文献 3:kitamoto等，《AppliedandlinvironmentalMicrobiology应用 与环境微生物学）》，1999年，第65卷，第20-24页。
[0017] 非专利文献 4:LaGrange等，《AppliedandlinvironmentalMicrobiology应用 与环境微生物学）》，2001年，第67卷，第5512-5519页。
[0018] 非专利文献 5 :化ao等，《AppliedandlinvironmentalMicrobiology(应用与环 境微生物学）》，2011年，第77卷，第719-726页。
[0019] 非专利文献6:Morais等，《JournalofBiologicalQiemistry(生物化学杂 志）》，2012年，第287卷，第9213-9221页。
【发明内容】
[0020] 本发明要解决的技术问题
[0021] 本发明的目的是提供一种至少在85°C且P册.0的条件下表现出W对硝基苯 基-β-D-化喃木糖巧（PNP讶为底物的水解活性的新耐热性β-木糖巧酶、编码上述耐热 性β-木糖巧酶的多核巧酸、用于表达上述耐热性β-木糖巧酶的表达载体、整合了上述表 达载体的转化体、W及使用上述耐热性β-木糖巧酶制造木质纤维素分解产物的方法。
[0022] 解决技术问题的技术手段
[0023] 本发明的发明人为了解决上述问题，通过从溫泉高溫±壤中直接提取DNA来进行 难培养微生物群的大规模宏基因组测序，成功获取具有新的氨基酸序列的耐热性β-木糖 巧酶，从而完成了本发明。
[0024]目Ρ，作为本发明的耐热性β-木糖巧酶、多核巧酸、表达载体、转化体、耐热性 0-木糖巧酶的制造方法、糖巧水解酶混合物、W及木质纤维素分解产物的制造方法，可W 列举下列山~[10]。
[00对 山一种耐热性β-木糖巧酶，其特征在于具有由下列（Α)、做或似构成的 β-木糖巧酶催化区域：
[0026] (Α)由序列号1所示氨基酸序列构成的多肤；
[0027] 度）由序列号1所示氨基酸序列中的至少一个氨基酸的缺失、取代或添加而形成 的氨基酸序列所构成的、并且至少在85°C且Ρ册.0的条件下具有W对硝基苯基-β-D-化喃 木糖巧为底物的水解活性的多肤； 阳02引 似由与序列号1所示氨基酸序列具有80%W上序列一致性的氨基酸序列构成 的、并且至少在85°C且P册.0的条件下具有W对硝基苯基-β-D-化喃木糖巧为底物的水解 活性的多肤。
[0029] 凹上述山的耐热性β-木糖巧酶，其进一步具有β-葡糖巧酶活性。
[0030] 閒一种多核巧酸，其具有由下列（a)~（e)的碱基序列构成的编码β-木糖巧酶 催化区域的区域：
[0031] (a)编码由序列号1所示氨基酸序列构成的多肤的碱基序列；
[0032] 化）编码由序列号1所示氨基酸序列中的至少一个氨基酸的缺失、取代或添 加而形成的氨基酸序列所构成的、并且至少在85 °C且P册.0的条件下具有W对硝基苯 基-β-D-化喃木糖巧为底物的水解活性的多肤的碱基序列；
[0033] (C)编码由与序列号1所示氨基酸序列具有80%W上序列一致性的氨基酸序列构 成的、并且至少在85°C且Ρ册.0的条件下具有W对硝基苯基-β-D-化喃木糖巧为底物的水 解活性的多肤的碱基序列；
[0034] (d)与序列号2或3所示碱基序列具有80%W上序列一致性、并且编码至少在 85°C且P册.0的条件下具有W对硝基苯基-β-D-化喃木糖巧为底物的水解活性的多肤的 碱基序列；
[0035] (e)与由序列号2或3所示碱基序列构成的多核巧酸在严格条件下进行杂交的多 核巧酸的碱基序列、且编码至少在85°C且P册.0的条件下具有W对硝基苯基-β-D-化喃木 糖巧为底物的水解活性的多肤的碱基序列。
[0036] [4]上述巧]的多核巧酸，上述多肤进一步具有β-葡糖巧酶活性。
[0037] [引一种表达载体，其整合了上述[3]或[4]的多核巧酸，在宿主细胞中可表达具 有0-木糖巧酶活性的多肤。
[00測 [6] -种转化体，其导入有上述閒的表达载体。
[0039] [7]上述[6]的转化体，其为真核微生物。 W40] 閒上述耐热性β-木糖巧酶的制造方法，其包括在上述[6]或[7]的转化体中生 产上述耐热性β-木糖巧酶。
[OOW[9] -种糖巧水解酶混合物，其包含上述山或凹的耐热性β-木糖巧酶、上述 [3]或[4]的多核巧酸编码的耐热性β-木糖巧酶、或者利用上述[引的耐热性β-木糖巧 酶的制造方法制得的耐热性β-木糖巧酶及至少一种其他糖巧水解酶。
[0042] [10] -种木质纤维素分解产物的制造方法，其包括使含有纤维素、半纤维素及木 质素的木质纤维素所形成的材料与上述[1]或[2]的耐热性β-木糖巧酶、上述[3]或[4] 的多核巧酸编码的耐热性β-木糖巧酶、上述[6]或上述[7]中记载的转化体、利用上述 [引的耐热性β-木糖巧酶的制造方法制得的耐热性β-木糖巧酶、或者上述[9]的糖巧水 解酶混合物接触，由此生产木质纤维素分解产物。 阳0创发明效果
[0044] 本发明的耐热性β-木糖巧酶至少在85°C且Ρ册.0的条件下具有W对硝基苯 基-β-D-化喃木糖巧（下面有时缩写为PNP讶为底物的水解活性。因此，上述耐热性β-木 糖巧酶适合于高溫条件下的、木质纤维素所形成的材料的糖化处理。
[0045] 此外，作为另一方面，上述耐热性β-木糖巧酶适合于高溫条件下的、包含具有 e-木糖巧键的低聚糖的材料的糖化处理。
[0046] 此外，作为又一方面，上述耐热性β-木糖巧酶适合于高溫条件下的、包含具有 0 -木糖巧键的低聚糖、或具有β-葡糖巧键的低聚糖的材料的糖化处理。
[0047]另外，上述包含具有β-木糖巧键的低聚糖的材料可通过例如对包含半纤维素的 木质纤维素进行木聚糖酶的水解而得到。上述包含具有β-葡糖巧键的低聚糖的材料可通 过例如对包含纤维素的木质纤维素进行纤维二糖水解酶的水解而得到。此外，本发明的多 核巧酸、整合了上述多核巧酸的表达载体、导入有上述表达载体的转化体适合用于制造本 发明的耐热性β-木糖巧酶。
【附图说明】
[0048] 图1为基因克隆AR19M-346-18的β-木糖巧酶活性催化区域的氨基酸序列（序 列号1)与F'ervidobacteriumgondwanense的G册木糖巧酶（序列号7)的氨基酸序列的 比对图。 W例 图2为表示实施例1中的AR19M-346-18基因在大肠杆菌中表达得到的 AR19M-346-18蛋白的SDS-PAGE分析结果的图。
[0050] 图3为表示实施例1中的大肠杆菌所表达的AR19M-346-18蛋白对各底物的水解 活性的测定结果的图。
[0051] 图4为表示实施例1中的大肠杆菌所表达的AR19M-346-18蛋白在各溫度下的 PNK(水解活性（P册.0)的测算结果的图。 阳05引 图5为表示实施例1中的大肠杆菌所表达的AR19M-346-18蛋白在各抑的PNPX 水解活性（70°C)的测算结果的图。
[0053] 图6为表示实施例1中的大肠杆菌所表达的AR19M-346-18蛋白示出的、伴随热变 性而引发的SYPR0化ange(宝石澄蛋白染色试剂）的巧光强度变化的图。
【具体实施方式】
[0054][耐热性β-木糖巧酶]
[0055] 众所