一种含有鲫鱼ifn干扰素的蓝藻工程菌及应用
【技术领域】
[0001] 发明属于生物技术领域，具体设及一种含有娜鱼IFN干扰素的蓝藻工程菌及应 用。
【背景技术】
[0002] 随着水产养殖业的快速发展，养殖期间病害亦越来越严重。大量、盲目使用抗生 素和化学合成药物不但防治效果差，而且还造成一系列不良后果。因此，国内外一些学者 从免疫学角度开展水产养殖病害防治研究，通过给水产动物服用免疫添加剂来提高动物体 的特异性和非特异性免疫机能，从而提高其抗病能力（朱小明，2005)。干扰素系统是机体 对抗病毒感染的一道重要防御系统，它与细胞免疫、体液免疫及其他非特异性免疫协同作 用抵抗病毒的侵染。在干扰素系统中产生的干扰素是一种广谱抗病毒剂，其作用是通过对 细胞表面受体作用使细胞产生抗病毒蛋白，抑制病毒在宿主细胞中的复制。还可增强自然 杀伤细胞、巨隧细胞和T淋己细胞的活力，从而起到免疫调节作用，增强抗病毒能力，在一 定程度上还影响细胞生长和分化等多种生物活性。鱼类干扰素同样具有广谱的抗病毒功 能，研究表明其能够诱导大量抗病毒基因的表达，包括其本身，形成一个正反馈作用，从而 保护机体避免病毒感染致死。
[0003] 重组干扰素作为一种蛋白质多肤类药物成功应用于人类和一些动物病毒病的防 治。鱼类养殖业使用重组干扰素防治疾病发生的方法思路有Ξ种，即注射、浸浴和口服。运 些方法的初步应用研究表明所用防治方法不同，疗效差异较大：仅注射免疫方式使鱼获得 一定的免疫保护，而拌料投喂（口服）和浸浴两种免疫方式未显示出免疫保护效果。然而， 在养殖实践中注射免疫过于耗时耗力，如何减少重组干扰素在消化道吸收过程中的损耗， 使更为便利和实用的投喂方式也同样发挥作用？运是对于养殖鱼类病毒病防治具有实用 价值的问题。
[0004] 蓝藻，作为高档水产养殖动物的饲料或饲料添加剂早已被广泛应用。蓝藻 SynechococcUSSP.PCC7002作为一种能够光合自养的微生物，其低廉的培养成本，高效 的生长速率W及特殊的细胞结构，为其作为产生干扰素化IFN的工程菌提供了很大潜力。 此外蓝藻Synechococcussp.PCC7002的全基因组测序与功能注释已经完成，分子和遗传 学操作十分方便；使得在蓝藻Synechococcussp.PCC7002中表达外源的干扰素化IFN基 因成为可能。本发明使用转基因蓝藻作为饲料添加剂加入鱼饲料中，减少了干扰素在投喂 过程中W及消化道中的损耗，实现了使用投喂的方式即能达到提高免疫保护效果的目的， 同时运种方法比注射免疫更为便利，适用于鱼类养殖业。因此，将转基因蓝藻作为饲料添加 剂添加到鱼饲料中，通过其中的干扰素来提高动物体的免疫机能，从而提高其抗病能力，为 开发安全的免疫增强型饲料提供一种解决方案。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供含有娜鱼IFN干扰素的蓝藻工程菌，通过转基因技术将娜 IFN(CalFN)基因克隆至蓝藻中，即可得到一种分泌干扰素的蓝藻工程菌。
[0006] 本发明的另一个目的在于提供含有娜鱼IFN干扰素的蓝藻工程菌的应用。该基因 工程菌可作为鱼饲料的添加剂，通过其中的干扰素来提高动物体的免疫机能，从而提高其 抗病能力。
[0007] 本发明还有一个目的在于提供了一种含有娜鱼IFN干扰素的蓝藻工程菌的鱼饲 料，饲料配方合理，该种饲料配方含有鱼类生长所需的各类营养及元素，满足鱼类的生长所 需，同时加入了含有干扰素化IFN的蓝藻，运些原料充分混匀后经饲料机做成大小合适的 饲料颗粒，方便投喂，减小干扰素在投喂过程中的消耗，也保护干扰素有效进入鱼体发挥免 疫保护效果。
[0008] 为了达到上述目的，本发明采用W下技术措施：
[0009] 含有娜鱼IFN干扰素的蓝藻工程菌，为将SEQIDNO. 1所示基因通过转基因的方 法转入蓝藻中得到。
[0010] 优选的，通过W下步骤获得：
[0011] 1、从娜鱼中扩增目的基因CaIFN(SEQIDNO. 1所示），将目的基因与T载体连接转 化大肠菌，得到阳性重组质粒化IFN-T。
[0012] 2、采用双酶切的方法，将目的基因从质粒化IFN-T上切下与含有同样酶切位点的 质粒pAEQ19(Dong}dXu2005;PlantPhysiology,July2005,Vol. 138,PP. 1586 - 1595)连 接，得到重组质粒质粒化IFN-PAEQ19。
[001引 3、利用常规方式将化IFN-pAEQ19转入蓝藻Synechococcussp.PCC7002中，经PC R检测，获得转基因蓝藻。
[0014] 含有娜鱼IFN干扰素的蓝藻工程菌的应用，包括利用该转基因蓝藻用于鱼饲料的 添加剂。将含有干扰素化IFN的蓝藻工程菌冷冻干燥后制成转基因蓝藻藻粉，按1 %~3% 的剂量添加进鱼饲料中。
[0015] 一种含有干扰素化IFN的蓝藻工程菌的鱼饲料，包括：
[0016] 组分 董量傲 鱼粉 40-訊 奸粉 五-8 蓝藻 1-4 α-淀粉 15
[0017] 玉米淀粉 15-20 鱼油 0 5-3 乂豆油 0.5-3 维生素预混料 0.1-().5 胆碱 0.1-0.5 矿物雜预混料 1-2 二水憐酸二氨轴1-2 憐酸二氨钟 ！-3 二水構酸氨巧 0.5-1.5 纤维素 5-i0 猿甲基纤维案 1-5 海藻酸钢 1-5
[0018] 所述的蓝藻为一种分泌干扰素化IFN的转基因，通过将化IFN基因克隆至蓝藻中 获得。一种含有干扰素化IFN的蓝藻工程菌的鱼饲料，包括W下配方（最佳配比）：
[0019] 组分 重量份 鱼粉 45.00 化粉 5.00 蓝藻 2.00 α-淀粉 10.00 玉米淀粉 17.00 鱼油 LOO 大豆油 1.00 维生素预混料 0.巧 腥碱 0.11 矿物盐预混料 二水靖酸二氨钢1.25 構酸二氨巧 L60 二水憐酸氨妈 0.77 巧维素 7.50 媛甲基纤维'素 3.00
[0020] 海藻繼銷 3胤；
[0021] 优选的，所述的维生素预混料，按1kg计，包括：维生素A0. 469g，维生素D 0. 128g，维生素E2. 564g，维生素K2. 564g，烟酸 25. 641g，核黄素 5. 128g，化唉醇 5. 128g， 硫胺5. 128g，泛酸巧12. 821g，生物素0. 026g，叶酸1. 282g，维生素B12 5. 128g，抗坏血酸 25. 641g，肌醇 25. 641g，麦教粉 882. 711g;
[0022] 所述的矿物质预混料，按1kg计，包括：氯化钢36. 232g，硫酸儀543. 478g，硫酸铁 90. 580g，乳酸巧126. 812g，硫酸锋12. 790g，硫酸儘5. 870g，硫酸铜1. 123g，硫酸钻0. 036邑， 舰化钟0. 109g，淀粉16. 304g，沸石粉166.666邑。
[0023] 与现有技术相比，本发明具有W下优点：
[0024] 1、蓝藻Synechococcussp.PCC7002是天然的感受态，一般不经过任何处理，即可 直接用于转化外源DNA。方便进行基因改造，使其成为生产干扰素化IFN的工程菌。此外其 低廉的培养成本，高效的生长速率使得生产成本大为下降。
[00巧]2、蓝藻富含蛋白质、多糖、不饱和脂肪酸和细胞色素等多种重要的生命活性物质， 作为高档水产养殖动物的饲料或饲料添加剂早已被广泛应用，是一种天然的理想的无公害 饲料添加剂。该种饲料配方含有转基因蓝藻，及鱼类生长所需的各类营养及元素，满足鱼类 的生长所需，利用含有干扰素的蓝藻作为饲料添加剂，减少了干扰素在投喂过程中W及消 化道中的损耗，实现了使用投喂的方式即能达到提高免疫保护效果的目的，同时运种方法 比注射免疫更为便利，适用于鱼类养殖业。因而通过改造蓝藻作为干扰素添加剂的载体，不 仅能使其高效表达干扰素化IFN来提高动物体的免疫机能，增强抗病能力，有效的减少抗 生素和化学合成药物的使用，蓝藻本身也富含蛋白质、多糖、不饱和脂肪酸和细胞色素等多 种重要的生命活性物质，是一种理想的鱼类巧料，运两者的结合有助于提高水产产品的品 质和产量。
[0026] 3.现有技术表明很多投喂方式添加干扰素不能显示出免疫作用，只有注射能够达 到干扰素的效果，本发明首次发现，通过蓝藻作为载体对干扰素进行表达，实现了投喂也可 有效的目的。
【具体实施方式】
[0027]本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案，所述试剂如未特别 说明，均购自商业渠道。
[0028] 实施例1:
[0029] 转基因CalFN蓝藻的获得
[0030] 对野生型娜鱼取肝脏，于液氮中速冻娠磨成粉末状。加入1mlTrizol充分混 匀，提取总RNA，反转录成cDNA库，对i化的0RF区域设计带酶切位点NdeI和BamHI 的引物AIgae-CalFN-F:ATCGCATATGATGAAAACTCAAATGTGG，Algae-CaIFN-R2:ATCGGGA TCCTTATCGTCTGTTGGCAAT进行PCR扩增。核酸凝胶电泳后通过胶回收得到DM片段，与载体 PAEQ19分别进行酶切，进行凝胶电泳再次回收DNA片段，16°C连接3小时，转化至大肠杆菌 D册α，挑取阳性克隆。转接至新鲜培养基，提取质粒。同时通过测序验证序列正确。
[0031] 引物序列如下：
[0032]Algae-CaIFN-FATCGCATATGATGAAAACTCAAATGTGG
[0033]Algae-CaIFN-R2ATCGGGATCCTTATCGTCTGTTGGCAAT
[0034]取培养的600ul聚球藻PC7002 (0D550nm值为0. 19)，6000r/min离屯、2min，弃 400ul上清液，加入制备好的质粒lOul，轻轻混匀，遮光静置4-8小时。将藻液均匀涂在A+ 固体培养基上，静置12-14小时，倒Topagar(；5mlTopagar包含链霉素35ul(lOmg/ml))。 静置培养15天左右。
[003引从A+固体培养基上挑选出单菌落，继续在已加入链霉素抗性的A+固体培养基上 培养，划线分离重复Ξ代，从最后一次的培养基上挑选单菌落进行扩大培养。
[0036] 检测转化的聚球藻P(X7002。采用PCR方法检测（邢州等，2009)。吸取野生型和转 化型的聚球藻PCC7002的藻液150ul，6000;r/min离屯、Imin，吸弃上清液，加入50ul无菌水 和20U1玻璃珠，使用Vodex振荡Imin，吸取上清液，并W此为模板，引物Algae-化IFN-F/ Algae-CaIFN-R2扩增目的基因约0. 5化长短的片段，产物进行电泳检测，获得转入外源基 因CalFN的转基因蓝藻。
[0037] 野生型聚球藻7002使用的培养基是A+培养基，转基因蓝藻使用的培养基是A+培 养基中添加抗生素链霉素，添加浓度为100μg/mL。野生型聚球藻7002和转基因蓝藻在平 板上生长时使用的是固体培养基，其他时候使用的是液体培养基。
[003引 A+液体培养基如下：
[0039]
[0040]
[0041] 补充说明:标的为事先单独灭菌然后在超净台加的组分。固体培养基配方为 在上述的液体培养基中添加1. 5%的琼脂粉。
[0042] 转基因蓝藻化IFN基因的表达活性的验证：
[004引总蛋白提取
[0044] 1.在蓝藻Synechococcussp.P