色原酮类衍生物和作为荧光染料的用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一类新的色原酮类衍生物、其制备方法及其作为荧光染料的用途，如 生命科学与基础医学研究领域。
【背景技术】
[0002] 荧光分子是指吸收某一波长的光波后能发射出大于吸收光波长的物质，荧光分子 化合物通常含有苯环或共轭杂环体系。荧光分子可用于活细胞成像、分子探针的合成、核酸 研究、高通量筛选、疾病诊断。由于荧光染料灵敏度高，操作方便，因而其广泛应用于荧光免 疫，荧光探针，细胞染色及活体染色等。因此被广泛应用在生命科学、基础医学、信息科学和 环境科学等方面。随着应用范围越来越广泛，荧光染料的研究发展迅速且受到了更多的重 视。
[0003] 已有的荧光染料已基本覆盖了由紫外到可见光及红外的整个光谱范围。尽管对于 荧光染料的需要越来越多，但是目前的荧光分子种类并不是很多，主要包括以下几大种类： 氧杂蒽类（罗丹明、荧光素），萘类（丹磺酰氯），香豆素类（7-氨基-4-甲基香豆素），蒽 类（蒽醌），芘类，噁嗪类（尼罗红、尼罗蓝），吖啶类（原黄素），四吡咯（卟啉）。其中普 遍用于生物学研究的荧光染料主要是罗丹明类，荧光素类，丹磺酰氯和香豆素类。各种荧光 分子的母核决定其具有不同的物理及化学性质，所以不同的荧光分子适合不同的生物研究 环境。目前的荧光分子均具有一些不足之处，所以，制备发现不同母核的荧光分子具有重大 的意义。
【发明内容】
[0004] 本专利中制备的荧光分子化合物在生物缓冲液中（pH>5)时能够释放出很强的荧 光，可以广泛地用于生命科学、基础医学、疾病诊断与环境科学中。这类荧光分子可以用来 标记蛋白或抗体，用于蛋白或抗体的组织或细胞的免疫成像；可以作为荧光标签与活性化 合物设计成分子探针，用于活细胞的细胞成像以及相互作用蛋白的鉴定研究；可以作为荧 光标签，用于生物化学筛选中，如酶活性、蛋白相互作用、生物大分子的相互作用的定量定 性筛选；可以作为荧光标签，用于临床检测试剂盒的设计中；可以设计成荧光探针，用于环 境监测，如苯硫污染水源。
[0005] 具体而言，本发明包括式I所示的化合物或其盐：
[0006]
[0007] &独立地选自1-6个碳的烷基、2-6个碳的烯基、2-6个碳的炔基或任选地被1-4 个R3基团取代的1-6个碳的烷基、2-6个碳的烯基、炔基；
[0008] 在每种情况下，r3独立地选自or4、NR4R5、羧基、醛基、叠氮基、卤素、顺丁烯二酰亚 胺、酰肼、羟氨、巯基、三氮唑、生物素、苯环或任选地被1-5个R6基团取代的苯环；
[0009] 1?4和1?5独立地选自H、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂环基和杂 芳基；
[0010] R6独立地选自〇R4、NR4R5、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、竣基、1*基、置 氮基、卤素、酰肼、羟氨、巯基、三氮唑、生物素；
[0011] η是0或1;
[0012] η= 0时，R2选自C3-6环烷基或3-8元饱和的或部分饱和的杂环，其中杂环可任 选地被取代并且其含有0-2个选自N、0和S的其它杂原子；
[0013] η= 1时，R2选自1-6个碳的烷基、2-6个碳的烯基、炔基或任选地被1-4个R3基 团取代的1-6个碳的烷基、2-6个碳的烯基、炔基；R3独立地选自0R4、NR4R5、羧基、醛基、叠 氮基、卤素、顺丁烯二酰亚胺、酰肼、羟氨、巯基、三氮唑、生物素、苯环或任选地被1-5个R6 基团取代的苯环；R4和馬独立地选自Η、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂 环基和杂芳基；1?6独立地选自0R4、NR4R5、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、竣基、酉全 基、叠氮基、卤素、酰肼、羟氨、巯基、三氮唑、生物素。
[0014] 优选的通式I所示的化合物，包括但不限定于，如通式IA所示的化合物
[0015]
[0016] 其中：
[0017] η是0或1;
[0018] η= 0时，R2选自C3-6环烷基或3-8元饱和的或部分饱和的杂环，其中杂环可任 选地被取代并且其含有0-2个选自N、0和S的杂原子；
[0019] η= 1时，R2选自1-6个碳的烷基、2-6个碳的烯基、炔基或任选地被1-4个R3基 团取代的1-6个碳的烷基、2-6个碳的烯基、炔基；R3独立地选自0R4、NR4R5、羧基、醛基、叠氮 基、卤素、顺丁烯二酰亚胺、酰肼、羟氨、巯基、三氮唑、苯环或任选地被1-5个R6基团取代的 苯环、生物素；
[0020] 1?4和R5独立地选自H、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂环基和杂 芳基；Re独立地选自OR4、NR4R5、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、竣基、酸基、置氣 基、卤素、酰肼、羟氨、巯基、三氮唑、生物素。
[0021] 优选的通式I所示的化合物，包括但不限定于，如通式IB所示的化合物
[0022]
[0023] 其中：
[0024] &独立地选自2-6个碳的烷基、2-6个碳的烯、炔基或任选地被1-4个R3基团取代 的1-6个碳的烷基、2-6个碳的烯、炔基；
[0025] 在每种情况下，R3独立地选自0R4、NR4R5、羧基、醛基、叠氮基、卤素、顺丁烯二酰亚 胺、酰肼、羟氨、巯基、三氮唑、苯环或任选地被1-5个R6基团取代的苯环、生物素；
[0026] 1?4和R5独立地选自H、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂环基和杂 芳基；
[0027] R6独立地选自〇R4、NR4R5、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、竣基、輕基、置 氮基、卤素、酰肼、羟氨、巯基、三氮唑、生物素；
[0028] m是0、1、2或3。
[0029] 最优选的化合物选自如下群组：
[0030]
[0033] 本发明还公开了本发明化合物色原酮结构的合成方法：
[0034]
[0035] 氩气保护下，将三氟化硼乙醚溶液（2mL)缓慢滴入试剂I(leq，5mm〇l)，试剂 II(leq, 5mmol)的混合物中，油浴加热110°C，两小时后，薄层层析板检测原料反应完全，移 至室温，缓慢滴入甲磺酰氯（1.2mL)，二甲基甲酰胺（2. 5mL)溶液，滴毕后，移至油浴加热回 流3-5小时，薄层层析板检测反应完全。将反应液倾入冰水中，乙酸乙酯萃取、饱和氯化钠 溶液洗涤、硫酸钠干燥，蒸出溶剂。硅胶柱层析分离最终产物，二氯甲烷：甲醇=100:1。
[0036] 本发明首先通过测定本发明色原酮衍生物光物理常数（包括但不限定于：摩尔消 光系数与最大吸收波长、最大荧光激发波长和荧光吸收波长、以及荧光量子产率）对本专 利中荧光分子的光物理性能进行评估，发现本发明的荧光分子在生命科学领域与基础医学 领域具有应用前景。
[0037] 研究发现本发明的荧光分子具有pH依赖的荧光强度。随着pH的增加，本发明荧光 分子显示出pH依赖的荧光强度增强。在pH5-8的缓冲溶液中，其显示出的中等荧光强度， 这种荧光强度已经足以满足各类生物试验的要求。当pH大于8时，该类荧光分子显示出非 常强的荧光量子产率与荧光强度。
[0038] 本发明的荧光分子在黑白相机下显示出非常强烈的光亮度。在黑白相机下，本发 明的荧光分子较商业荧光对照化合物7-氨基-4-甲基香豆素（AMC)显示出更加明显的荧 光亮度。考虑到黑白相机在生物成像（荧光显微镜）中的广泛应用，这更加有利于本专利 中的荧光分子在生物成像中的应用。
[0039] 进一步的研究发现，本发明的荧光分子能用于荧光成像来检测目标化合物在细胞 内分布。首先，将目标化合物（含有能够与荧光分子反应的基团，如炔基）与细胞共同孵育， 从而使目标化合物特异定位于细胞内，之后将细胞固定。采用荧光分子（含有反应基团，如 叠氮基团），通过化学反应方法（如点击化学）将荧光分子与目标化合物连接到一起形成稳 定的化学键（如三氮唑类结构）。之后用0. 1MTris-HCl，pH8. 0的缓冲液洗掉没有反应的 荧光分子，在倒置显微镜下观察到部分细胞结构发蓝色荧光，也即荧光分子能够特异性的 标记目标化合物。
[0040] 本发明的荧光分子能用于组织样品的荧光成像来检测目标化合物在组织细胞内 的分布。组织样品的荧光染色对于荧光染料的要求较高，这是因为组织样品通常对于荧光 染料有非特异性的吸附，所以需要荧光染料具有非常强烈的亮度。肿瘤组织的石蜡切片脱 蜡后和本发明的荧光染料通过化学反应标记组织细胞内的目标化合物，洗去没有反应的荧 光染料后在正置荧光显微镜观察，到肿瘤组织中细胞器结构是显示染蓝色荧光，说明本发 明的荧光分子能用于组织的荧光成像。
【附图说明】
[0041] 图1，不同pH值下荧光分子IA-1的荧光
[0042] 图2,本专利中荧光分子IA-1到IA-5与异黄酮类天然产物及商业染料AMC在黑白 相机中的成像的比较。第1行的三个孔分别为异黄酮类天然产物（大豆素、芒柄花黄素和 黄豆黄素）；第2孔第1孔为商业染料7-氨基-4甲基香豆素（AMC)，第3行5个孔为本专 利中的荧光分子IA-1到IA-5。
[0043] 图3,荧光分子IA-5特异性标记细胞核DNA中的EdU，即细胞核特异性荧光染色
[0044] 图4,采用荧光染料IA-5标记肿瘤组织细胞核DNA中插入的EdU。
【具体实施方式】
[0045] 下面通过实施例来说明本专利的可实施性，本领域的技术人员应该理解，根据现 有技术的指导，对相应技术特征进行修改或替换，仍然属于本发明要求保护的范围。
[0046] 实施例
[0047] 色原酮结构的合成通法，实施例中所列举的化合物中色原酮结构均参照下述操作 合成：
[0048]
[0049] 氩气保护下，将三氟化硼乙醚溶液（2mL)缓慢滴入试剂I(leq，5mm〇l)，试剂 II(leq，5mmol)的混合物中，油浴加热110°C，两小时后，薄层层析板监测原料试剂反应完 全，移至室温，缓慢滴入甲磺酰氯（1.2mL)，二甲基甲酰胺（2. 5mL)溶液，滴毕后，移至油浴 加热回流3-5小时，薄层层析板监测反应完全。将反应液倾入冰水中，乙酸乙酯萃取、饱和 氯化钠溶液洗涤、硫酸钠干燥，蒸出溶剂。硅胶柱层析分离最终产物，二氯甲烷：甲醇= 100:1〇
[0050] 本专利中个别化合物是在已经制备的色原酮类似物的基础上进一步修饰，详见具 体的实施例。
[0051] 实施例1 :3- 丁基-7-羟基-6-甲氧基-4H-色烯-4-酮化合物（IA-1)
[0052]
[0053] 以4-甲氧基-1，3-苯二酚、正己酸为原料，按照合成通法的操作，制备得白色 固体 434mg。4NMR(400MHz，DMS0)δ= 10. 49 (s，1H)，8. 07 (s，1H)，7. 36 (s，1H)，6. 89 ( s，1Η)，3·86(s，3Η)，2· 34 (t，J= 7. 5Hz，2Η)，1· 56-1. 41 (m，2Η)，1· 36-1. 19 (m，2Η)，0· 89 (t，J= 7.3Hz，3H);13CNMR(101MHz，CDCl3)S= 180.77，157.90，157.33